嬰幼兒腹瀉人群中鼠傷寒沙門菌的流行病學(xué)及多重耐藥特征研究

王路梅，郭 惠，童 晶，吳畏畏，劉庭君，鄭東宇

鼠傷寒沙門菌是沙門菌屬中引起小兒腸道感染最常見(jiàn)的致病血清型[1-2]，屬于沙門菌群B群。人群對(duì)鼠傷寒沙門菌普遍易感，嬰幼兒多為顯性感染，以胃腸型為主[3]，相關(guān)研究中多是以兒童為研究對(duì)象，嬰幼兒(0～3歲)感染資料尚不足。嬰幼兒免疫功能尚未完善，抵抗力較弱，抗菌藥物是治療兒童鼠傷寒沙門菌腸炎的重要手段，多重耐藥鼠傷寒沙門菌已在世界各地陸續(xù)報(bào)道[4-5]，耐頭孢菌素鼠傷寒沙門氏菌的出現(xiàn)及數(shù)量的增加已經(jīng)引起全世界的關(guān)注，成為臨床治療的難點(diǎn)。為了掌握鼠傷寒沙門菌在嬰幼兒腹瀉人群中的流行情況，了解其多重耐藥特征，防止多重耐藥菌在弱勢(shì)人群中的傳播，遏制不合理抗生素應(yīng)用，本研究對(duì)2014—2018年徐州地區(qū)嬰幼兒腹瀉人群進(jìn)行了鼠傷寒沙門菌監(jiān)測(cè)，并對(duì)其耐藥特征和多耐藥菌株之間的分子流行病學(xué)關(guān)系進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 依托全國(guó)食源性疾病監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，收集2014－2018年徐州市醫(yī)院1 343份嬰幼兒(0～3歲)腹瀉病患者糞便標(biāo)本，病例以腹瀉癥狀為主訴，近1周內(nèi)未使用過(guò)抗生素，每日排便大于3次及3次以上，且糞便性狀異常。

1.1.2 質(zhì)控菌株 血清分型質(zhì)控菌株為鼠傷寒沙門氏菌ATCC140128，藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922，上述菌株購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)，脈沖場(chǎng)凝膠電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)菌株為沙門氏菌H9812，由江蘇省疾病預(yù)防控制中心食安所提供。

1.1.3 主要儀器和試劑 VITEK 2 COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國(guó)梅里埃公司);PCR擴(kuò)增儀、脈沖場(chǎng)凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司);SBG增菌液(廣州環(huán)凱微生物試劑有限公司);科瑪嘉沙門顯色培養(yǎng)基(上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司);沙門氏菌屬診斷血清(寧波天潤(rùn)生物制品研究所及丹麥S&A);Vitek GN鑒定卡、GN 13、GN 14藥敏測(cè)試卡(法國(guó)梅里埃公司);藥敏測(cè)試用紙片:頭孢他啶30μg、頭孢他啶/克拉維酸30/10μg和頭孢噻肟30μg、頭孢噻肟/克拉維酸30/10μg，(英國(guó)OXID公司);限制性內(nèi)切酶Xba I、Bl n I購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;脈沖場(chǎng)電泳用瓊脂糖為Sea Kem○RGold Agarose低熔點(diǎn)瓊脂(美國(guó)Ca mbrex公司);蛋白酶K為德國(guó)Merck公司產(chǎn)品。質(zhì)粒小提取試劑盒(DP106)為天根生化科技公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1 分離鑒定 按照《GB 4789.4-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門菌檢驗(yàn)》、2014－2018《全國(guó)食源性疾病監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》進(jìn)行沙門菌的分離、鑒定病原學(xué)表型檢測(cè)。

1.2.2 沙門菌血清分型 按照考夫曼抗原表[6]，將鼠傷寒沙門氏菌分為雙相的鼠傷寒沙門菌血清型(1，4，12:i:1，2)和單相變體的鼠傷寒沙門菌變種血清型(1，4，12:i:—)。

1.2.3 耐藥模型檢測(cè) 采用VITEK 2 Co mpact GN13和GN14藥敏系統(tǒng)的最低抑菌濃度法(MIC)測(cè)定72株菌對(duì)10類抗生素18種代表藥物的敏感性。參照CLSI M100-S26[7]《美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行抗生素分類和判斷結(jié)果。按照臨床實(shí)際用藥規(guī)范[8]，排除對(duì)沙門菌無(wú)效的一代頭孢，根據(jù)多重耐藥定義[9]，對(duì)上述3類或3類以上抗菌藥物不敏感定義為MDR(multidrug resistant)，對(duì)上述6類或6類以上抗菌藥物不敏感定義為XDR(extensive drug resistant)。

1.2.4 產(chǎn)ESBLs表型檢測(cè) 按照CLSI M100-S26[7]中的雙紙片協(xié)同法來(lái)確定鼠傷寒沙門菌的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)耐藥表型，并且嚴(yán)格進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.2.5 產(chǎn)ESBLs耐藥基因CTX-M檢測(cè)及產(chǎn)物確定 對(duì)產(chǎn)ESBLs表型菌株檢測(cè)常見(jiàn)耐藥基因CTXM及其亞型，按照細(xì)菌質(zhì)粒提取參考小提試劑盒說(shuō)明書的堿裂解法對(duì)細(xì)菌質(zhì)粒DNA進(jìn)行提取，對(duì)6種特異耐藥基因[5]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性15 s，退火15 s，72℃延伸30 s，反應(yīng)共30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。PCR陽(yáng)性擴(kuò)增片段送上海生物工程公司測(cè)序驗(yàn)證，使用BLAST在Gen Bank上查詢比較，確定基因亞型。

1.2.6 PFGE分型及數(shù)據(jù)分析 PFGE操作實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程采用Pulse Net標(biāo)準(zhǔn)操作手冊(cè)規(guī)定進(jìn)行。PFGE結(jié)果采用Bio Nu merics(Applied—maths公司，ver6.6)進(jìn)行分析處理，采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)計(jì)算用Excel 2007構(gòu)建病原菌流行特征，分析統(tǒng)計(jì)耐藥情況，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間比較采用卡方檢驗(yàn)或者校正卡方檢驗(yàn)，單向有序計(jì)數(shù)資料的變化趨勢(shì)用趨勢(shì)卡方分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 鼠傷寒沙門菌在嬰幼兒腹瀉人群中的流行病學(xué)特征

2.1.1 時(shí)間分布 2014－2018年，1 343份腹瀉嬰幼兒標(biāo)本中，共檢出178株沙門氏菌(13.25%)，其中鼠傷寒沙門菌檢出72株(5.36%)。2014－2018年沙門菌(χ2趨勢(shì)＝21.23，P＜0.01)和鼠傷寒沙門菌(χ2趨勢(shì)＝16.02，P＜0.01)檢出率均呈逐年上升趨勢(shì);5年間，鼠傷寒血清型在沙門菌中的占比亦呈逐年增高的趨勢(shì)(χ2趨勢(shì)＝18.47，P＜0.01)，2018年達(dá)到最高為62.50%，見(jiàn)表1。沙門菌全年均有檢出，鼠傷寒沙門菌僅在2－11月才有檢出，沙門菌檢出高峰出現(xiàn)在6月(19.25%)，鼠傷寒沙門菌檢出高峰出現(xiàn)在5月(8.16%)，5－10月沙門菌的檢出率均處于較高水平，見(jiàn)圖1。

表1 2014－2018年徐州地區(qū)嬰幼兒腹瀉人群中鼠傷寒沙門菌檢出情況Tab.1 Detection of salmonella typhus in infant and infant diarrhea patients in Xuzhou region from 2014 to 2018

圖1 2014－2018年患兒鼠傷寒沙門菌及沙門菌感染發(fā)病時(shí)間Fig.1 Onset time of salmonella typhus and salmonella infection in children from 2014 to 2018

2.1.2 年齡、性別分布 1 343例嬰幼兒腹瀉人群年齡范圍為0 d～3歲，平均年齡1歲2個(gè)月，中位數(shù)為1歲4個(gè)月;72例鼠傷寒檢出人群的年齡范圍為:7 d～3歲，沙門菌和鼠傷寒沙門菌在1～3歲幼兒組的檢出率均高于＜1歲嬰兒組(χ2＝88.91，P＜0.01;χ2＝80.53，P＜0.01)(見(jiàn)表2);男患兒鼠傷寒檢出率為54.9%(45/859)，女患兒為13.22%(27/484);男女病例之比為1.67∶1，檢出率在性別間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝0.02，P＞0.05)。

2.1.3 臨床感染特征和飲食史 1 343份腹瀉患兒樣本中，膿血便中鼠傷寒沙門菌的檢出率為22.84%(37/162)，高于稀便的3.89%(13/334)、水樣便的2.89%(12/415)、粘液便的2.62%(10/382)(χ2＝105.66，P＜0.01)，米泔樣便、鮮血便和其他便未有檢出鼠傷寒沙門菌。56.9%(41/72)的鼠傷寒感染患兒出現(xiàn)發(fā)熱。經(jīng)過(guò)餐飲史調(diào)查表明，48.6%(35例)陽(yáng)檢患兒為正常飯菜飲食，23.6%(17例)為混合飲食，12.5%(9例)為母乳喂養(yǎng)，15.28%(11例)為奶粉喂養(yǎng)。

表2 72株鼠傷寒沙門菌在嬰幼兒腹瀉人群中年齡分布Tab.2 Age distribution of 72 strains of salmonella typhimurium in infant diarrhea population

2.2 72 株鼠傷寒沙門菌耐藥情況 藥敏結(jié)果顯示，耐藥率＞90%的抗生素有:一代頭孢類藥和頭霉素類、氨基糖苷類的阿米卡星，慶大霉素，妥布霉素;耐藥率＞80%的抗生素有:青霉素類的氨芐西林、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物中的氨芐西林/舒巴坦。耐藥率＜10%的抗生素有:哌拉西林/他坐巴坦，厄他培南，亞胺培南，呋喃妥因，左氧氟沙星。產(chǎn)ESBLs表型陽(yáng)性株對(duì)氨芐西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、氨曲南的耐藥率高于非產(chǎn)ESBLs表型株(χ2＝4.57，P＜0.05;χ2＝38.66，P＜0.01;χ2＝45.53，P＜0.01)，單相變體的鼠傷寒沙門菌變種血清型(1，4，，12:i:－)和雙相的鼠傷寒沙門菌血清型(1，4，12:i:1，2)之間的耐藥特征差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，詳見(jiàn)表3。

表3 72株鼠傷寒沙門菌耐藥情況[耐藥數(shù)(%)]Tab.3 Drug resistance of 72 strains of Salmonella typhimurium[numberof drug resistance(%)]

A M-氨芐西林、A MS-氨芐西林/舒巴坦、TZP-哌拉西林/他唑巴坦、CFZ-頭孢唑林、CTT-頭孢替坦、CAZ-頭孢他啶、CTR-頭孢曲松、FEP-頭孢吡肟、ATM-氨曲南、ETP-厄他培南、I MP-亞胺培南、AK-阿米卡星、GM-慶大霉素、TM-妥布霉素、CIP-環(huán)丙沙星、LEV-左氧氟沙星、F/M-呋喃妥因、SXT-甲氧芐啶/磺胺甲惡唑。

2.3 耐藥模型及多重耐藥情況 65株(90.28%)鼠傷寒沙門菌為多重耐藥菌，其中，30株(41.67%)為MDR，呈現(xiàn)XDR耐藥的有35株(48.61%)，72株鼠傷寒沙門菌對(duì)18種抗生素的耐藥譜呈37種模型;最多對(duì)9類14種抗生素耐藥，詳見(jiàn)表4。

表4 72株鼠傷寒沙門菌的多重耐藥模型Tab.4 Model of multiple drug resistance of 72 strains of salmonella camphoris in mice

2.4 產(chǎn)ESBLs鼠傷寒的耐藥表型及CTX-M各耐藥基因檢測(cè) 72株鼠傷寒沙門菌中，15株(20.83%)產(chǎn)ESBLs表型，其中13株攜帶CTX-M通用基因，3株來(lái)自2014年，2株來(lái)自2015年，8株來(lái)自2016年，2株來(lái)自2018年。對(duì)13株菌進(jìn)行耐藥基因擴(kuò)增分型，結(jié)果顯示4株blaCTX-M-1、9株bla CTX-M-9擴(kuò)增結(jié)果陽(yáng)性。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，序列通過(guò)BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)分別與已知的blaCTX-M-1、blaCTX-M-9序列100%同源。CTXM-2組及CTX-M-8/CTX-M-25組擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，陰性對(duì)照成立。

2.5 PFGE圖譜聚類分析結(jié)果 72株鼠傷寒沙門菌可分為66個(gè)PFGE帶型，相似度在57.2%～100%之間變化，按照90%以上的相似度，可分為11個(gè)聚類。37株菌的相似度在90%～96.6%之間變化，包含多重耐藥菌和非多重耐藥菌;相同耐藥譜的菌株之間帶型相似度均＜80%;12株鼠傷寒沙門菌變種之間的PFGE圖譜特征相似度＜80%;9株多重耐藥鼠傷寒沙門菌出現(xiàn)4簇100%一致帶型，其中1簇為2株2018年不同時(shí)間分離的鼠傷寒沙門菌和鼠傷寒沙門菌變種，均為多重耐藥菌。1簇為2017年5月13日分離的鼠傷寒沙門菌。1簇為分別于2016年、2018年分離的2株鼠傷寒沙門菌，1簇分別為2016年、2017年、2018年分離的3株鼠傷寒沙門菌。2株非多重耐藥鼠傷寒沙門菌出現(xiàn)一簇100%一致帶型，為分別于2017年5月和10月分離，詳見(jiàn)圖2。

2.6 院內(nèi)感染流行病學(xué)調(diào)查 172例鼠傷寒患兒中，1例為2016年9月1日發(fā)現(xiàn)新生兒院內(nèi)感染。對(duì)其父母親、護(hù)理人員的糞便、手標(biāo)本、產(chǎn)婦傷口、產(chǎn)道等樣本進(jìn)行連續(xù)3天病原檢索，均未檢出病原菌;產(chǎn)婦為剖宮產(chǎn)，近1周內(nèi)無(wú)細(xì)菌感染史。2016年8月24日患兒出生時(shí)一切正常，于7天后出現(xiàn)哭鬧不適，膿血便(11次/日);糞便培養(yǎng)檢出鼠傷寒沙門菌。遂查看該醫(yī)院同一病區(qū)近1個(gè)月內(nèi)住院病人資料，2016年8月27－30日，同一病區(qū)有2例住院患者為鼠傷寒沙門菌感染?；純喊l(fā)病后，醫(yī)院加強(qiáng)消毒處理，醫(yī)院外環(huán)境、護(hù)士標(biāo)本中均未檢出病原。綜上，此例為嬰兒出生后在院內(nèi)發(fā)生的交叉感染。

3 討 論

鼠傷寒沙門菌是目前世界各國(guó)分離率最高的沙門菌型之一，主要以兒童感染為主[10]，在我國(guó)臨床感染沙門菌中27.4%是由鼠傷寒沙門菌引起的[11]。2014－2018年徐州地區(qū)嬰幼兒腹瀉人群中鼠傷寒感染率在沙門菌中的占比為40.45%，其中2018年高達(dá)62.50%，并呈逐年上升的趨勢(shì)。和文獻(xiàn)中兒童鼠傷寒感染數(shù)據(jù)范圍(16.0%～68.6%)相比，處于較高水平[12-16]。0～3歲的腹瀉人群中，以1～3歲幼兒年齡組檢出率較高，相對(duì)于0～1歲的嬰兒時(shí)期，幼兒的戶外活動(dòng)頻繁，易食用不潔食品及飲品，感染的風(fēng)險(xiǎn)增加。本組研究中，最小嬰兒發(fā)病年齡僅7 d，小于羅文雄[17]報(bào)道的36 d，經(jīng)調(diào)查，本例為剖宮產(chǎn)后住院期間感染，其他地區(qū)亦出現(xiàn)鼠傷寒沙門菌引發(fā)的初生嬰兒院內(nèi)交叉感染報(bào)道[18]，提示初生嬰兒院內(nèi)感染的風(fēng)險(xiǎn);因此，嬰幼兒腹瀉患者已成為該地區(qū)鼠傷寒沙門菌感染重點(diǎn)人群，今后應(yīng)從飲食衛(wèi)生和院內(nèi)感染方面加以控制鼠傷寒沙門菌的污染。

圖2 72株鼠傷寒沙門菌的PFGE圖譜聚類分析Fig.2 Cluster analysis of PFGE map of 72 strains of salmonella typhus

脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)現(xiàn)已被廣泛用于多種病原體暴發(fā)流行、院內(nèi)感染的溯源分析中。經(jīng)過(guò)對(duì)72株鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行PFGE分子分型研究顯示，100%一致帶型最多的有3株菌，無(wú)明顯的優(yōu)勢(shì)帶型。提示嬰幼兒人群攜帶的鼠傷寒沙門氏菌基因型呈多樣性，沒(méi)有優(yōu)勢(shì)的流行基因型。此外，72株鼠傷寒沙門氏菌PFGE帶型無(wú)3例以上的地域、時(shí)間的聚集性，反映鼠傷寒沙門氏菌在該地區(qū)嬰幼兒人群中呈散發(fā)流行。值得關(guān)注的是，72株鼠傷寒沙門菌中，有9株多重耐菌出現(xiàn)4簇100%一致帶型，提示多重耐藥鼠傷寒菌株在嬰幼兒人群存在小范圍傳播的可能。因此，仍需繼續(xù)關(guān)注相關(guān)耐藥菌的水平傳播。

單相變體鼠傷寒沙門氏菌(1，4，[5]，12:i:－)是鼠傷寒沙門菌的一種血清型，定義為鼠傷寒沙門菌變種，已被證明與鼠傷寒沙門菌具有相似的毒力和耐藥特征。本研究中檢出12株鼠傷寒沙門變種，耐藥情況產(chǎn)生了一致的結(jié)論。通過(guò)PFGE分子分型溯源，未發(fā)現(xiàn)單相變體血清型菌株出現(xiàn)聚集性趨勢(shì)，但是樣本量尚少，需要加大樣本量，深入研究。

總體看來(lái)，徐州地區(qū)鼠傷寒沙門菌嬰幼兒分離株的多重耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，呈現(xiàn)MDR和XDR的菌株共占比90.28%。ESBLs表型陽(yáng)性株占20.83%，產(chǎn)ESBLs的菌株應(yīng)避免使用青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南類藥物。產(chǎn)ESBLs鼠傷寒沙門菌的耐藥基因是以攜帶blaCTX-M-1和bla CTX-M-9亞型為主，亞型分布地區(qū)的差異與各地臨床使用的抗菌藥物不同有關(guān)。作為兒童治療沙門菌感染的首選藥物，三代頭孢類的頭孢他定(25.00%)和頭孢曲松(37.50%)耐藥率令人擔(dān)憂，在近期的兒科感染使用中應(yīng)加以控制，四代頭孢類的頭孢吡肟的耐藥率目前低于20%，仍是頭孢類最佳選擇。哌拉西林/他唑巴坦及碳青霉烯類的厄他培南和亞胺培南目前耐藥率仍呈現(xiàn)較低的水平，左氧氟沙星雖然耐藥率較低(8.33%)，但是對(duì)兒童軟骨發(fā)育有影響，僅用于治療嚴(yán)重沙門菌或多耐藥感染。

由于嬰幼兒人群的鼠傷寒感染相關(guān)資料尚少，期望通過(guò)本研究能提高臨床對(duì)鼠傷寒沙門菌感染及耐藥性的認(rèn)識(shí)，遏制兒科不合理抗生素應(yīng)用。