微生物共培養(yǎng)降解β-氯氰菊酯的適宜條件

蘇宏南，陳切希，趙甲元，遲原龍，賈冬英，姚開*

1(四川大學 輕紡與食品學院，四川 成都，610065) 2(旌陽區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，四川 德陽，618000) 3(四川師范大學 生命科學學院，四川 成都，610101)

β-氯氰菊酯(β-cypermethrin，β-CY)是一種高效擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，被廣泛應(yīng)用于果蔬、谷物等蟲害的防治。β-氯氰菊酯疏水性強、對光熱穩(wěn)定，自然條件下降解緩慢，在中性土壤中的半衰期可達165 d[1]，長期施用易造成土壤和農(nóng)產(chǎn)品中殘留量超標，進而對生物體造成危害[2]。微生物降解法因其高效、安全等特點，已成為降解農(nóng)藥的首選方法之一[3]。

通常，土壤環(huán)境中的混合菌株比單一菌株具有更強的農(nóng)藥降解能力[4]，尤其是具有菌絲體結(jié)構(gòu)的菌株，不僅自身對污染物會有一定的降解作用[5]，還能使其他微生物借助其菌絲體穿越土壤的空隙層，實現(xiàn)更大范圍的分散，增大微生物與土壤中污染物的接觸概率，提高污染物的降解率。此外，菌絲體還能刺激其他微生物的生長和生物活性的表達，從而更有利于微生物作用于土壤中的污染物[6]。

本文以長期噴施擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的菜園土壤為菌源，篩選得到對β-氯氰菊酯具有降解能力的放線菌，并將其與前期篩選得到的對β-氯氰菊酯具有較強降解能力的地衣芽孢桿菌B-1共同培養(yǎng)，考察其對β-氯氰菊酯的適宜降解條件和降解效果，為農(nóng)產(chǎn)品和糧食中殘留的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥生物降解的深入研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

(1) 試劑：β-氯氰菊酯標準品(純度為99.7%，國家標準物質(zhì)中心)，色譜純乙腈(美國TEDIA試劑公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

(2) 查氏培養(yǎng)基(CDM)：蔗糖30 g，NaNO31.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4·3H2O 1.0 g，F(xiàn)e2(SO4)30.01 g，胰蛋白胨0.5 g，吐溫80 2.0 mL，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121℃滅菌20 min。

(3) 高氏一號培養(yǎng)基(GSM)：可溶性淀粉20 g，KNO31.0 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，吐溫80 2.0 mL，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121℃滅菌20 min。

(4) LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g，酵母膏2.0 g，NaCl 10 g，吐溫80 2.0 mL，去離子水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-10AT高效液相色譜儀，日本島津公司；TU-1800PC紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；GL-20G-C高速冷凍離心機，上海安亭飛鴿有限公司。

1.3 菌株篩選和鑒定

(1) 菌株B-1：本實驗室前期從茶園土壤中篩選和馴化得到的地衣芽孢桿菌B-1(BacilluslicheniformisB-1)，其在一定條件下對β-氯氰菊酯的降解率為77.0%。

(2) 菌株K-1：從長期噴灑擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的菜園土壤中篩選得到的放線菌。

取土樣1.5 g，置于裝有28.5 mL CDM培養(yǎng)基(β-氯氰菊酯含量為50 μg/mL)的250 mL錐形瓶中，35℃振蕩(150 r/min)培養(yǎng)72 h；然后按5.0%轉(zhuǎn)接量，依此條件再進行3次重復(fù)培養(yǎng)，并依次提高培養(yǎng)基中β-氯氰菊酯含量，分別為100、200、300 μg/mL；將最后一級培養(yǎng)液稀釋后涂布于GSM瓊脂培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)72 h，對菌落進行分離和純化，從中篩選出對β-氯氰菊酯具有較強耐受性和較好降解能力的理想放線菌。

參照陳少華等的方法對篩選的理想菌株進行生理生化鑒定[8]。菌株16S rDNA測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，從GenBank數(shù)據(jù)庫中選擇同源性高的16S rDNA基因序列，利用軟件ClustalX2.3和MEGA6.0構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 β-氯氰菊酯含量的測定

用乙腈配制一系列不同含量的β-氯氰菊酯的標準溶液，參照劉芳芳的方法[7]，測定β-氯氰菊酯的HPLC峰面積，平行重復(fù)3次，取其平均值。對β-氯氰菊酯含量(X)與其峰面積(Y)進行線性擬合，得到標準曲線方程：Y=68 023X+26 227，R2=0.999 9。

將降解體系勻漿，取5.0 mL降解液與等體積乙腈混合，超聲(80 Hz，160 W)30 min，離心(8 000 r/min)20 min，上清液過有機濾膜(0.45 μm)，濾液進行HPLC檢測，根據(jù)標準曲線方程計算β-氯氰菊酯含量，并按公式(1)計算降解率。

降解率/%=(1-D/Dk)×100

(1)

式中:D,降解液中β-氯氰菊酯含量;Dk,空白對照組中β-氯氰菊酯含量。

1.5 菌懸液的制備

(1) 菌株B-1菌懸液:將活化的菌株B-1接種于LB培養(yǎng)基中(β-氯氰菊酯含量為50 μg/mL)，35 ℃振蕩(150 r/min)培養(yǎng)48 h，冷凍離心(4 ℃，8 000 r/min)10 min，沉淀用無菌生理鹽水復(fù)溶，調(diào)整細胞濃度，制成OD600值為0.8的菌株B-1菌懸液。

(2) 菌株K-1孢子懸液：將活化的菌株接種于GSM瓊脂培養(yǎng)基上(β-氯氰菊酯質(zhì)量濃度為100 μg/mL)，30 ℃培養(yǎng)72 h。用無菌生理鹽水洗下孢子，振蕩混勻，調(diào)整其濃度，制成OD600值為1.0的菌株K-1孢子懸液。

1.6 菌株共培養(yǎng)降解β-氯氰菊酯適宜條件的選擇

(1) 培養(yǎng)基組成：將GSM培養(yǎng)基與LB培養(yǎng)基分別按1∶0、1∶1、0∶1(v/v)的比例混合，分別取β-氯氰菊酯含量為50 μg/mL的混合培養(yǎng)基28.5 mL，分裝于250 mL錐形瓶中。以1∶1(K-1∶B-1，v/v)的接種比例，分別接入菌懸液或孢子懸液，總接種量為5.0%(v/v)，以等量的無菌生理鹽水替代菌懸液及孢子懸液作為空白對照，35℃振蕩(150 r/min)培養(yǎng)72 h，檢測β-氯氰菊酯的含量，并計算其降解率。

(2) 接種比例:取β-氯氰菊酯質(zhì)量濃度為50 μg/mL的混合培養(yǎng)基28.5 mL，分裝于250 mL錐形瓶中。按5.0%(v/v)的接種量，分別以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶0、0∶1(K-1∶B-1，v/v)的比例接入其菌懸液或孢子懸液，以等量的無菌生理鹽水替代菌懸液及孢子懸液作為空白對照，35 ℃振蕩(150 r/min)培養(yǎng)72 h，檢測β-氯氰菊酯的含量，并計算其降解率。

(3) 接種方式：取β-氯氰菊酯質(zhì)量濃度為50 μg/mL的混合培養(yǎng)基28.5 mL，分裝于250 mL錐形瓶中。分別按以下3種方式接入適宜比例的菌懸液或孢子懸液，總接種量為5.0%(v/v)，以等量的無菌生理鹽水替代菌懸液及孢子懸液作為空白對照，35 ℃振蕩(150 r/min)培養(yǎng)72 h，檢測β-氯氰菊酯的含量，并計算其降解率:

①先接種菌株K-1，培養(yǎng)24 h后接種菌株B-1；

②先接種菌株B-1，培養(yǎng)24 h后接種菌株K-1；

③同時接種菌株K-1和菌株B-1。

1.7 菌株共培養(yǎng)降解β-氯氰菊酯的動力學分析

分別取β-氯氰菊酯質(zhì)量濃度為50、100、200 μg/mL的混合培養(yǎng)基28.5 mL，分裝于250 mL錐形瓶中，按5.0%(v/v)的接種量和2∶1的比例(K-1∶B-1，v/v)接入菌懸液或孢子懸液，35 ℃振蕩(150 r/min)培養(yǎng)5 d，定時取樣，檢測β-氯氰菊酯的含量。選用Logistic方程[9]并利用軟件Origin 8.0對不同β-氯氰菊酯含量隨培養(yǎng)時間的變化進行非線性擬合。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株K-1的鑒定

菌株K-1的生理生化特征如表1所示，其16S rDNA基因的PCR擴增結(jié)果如圖1所示。可以看出，菌株K-1符合鏈霉菌特征[8]，其16S rDNA擴增產(chǎn)物凝膠電泳的顯示結(jié)果與測序長度1 273 bp吻合。BLAST基因同源性分析結(jié)果表明，菌株K-1與Streptomycesneopeptiniusstrain T41(GenBank登錄號為KU317914.1)及Streptomyceschartreusisstrain S14(GenBank登錄號為KT958872.1)均有99%的同源性，據(jù)此建立的系統(tǒng)進化樹如圖2所示。綜合菌株K-1的生理生化特征及序列比對結(jié)果，最終鑒定其為一株鏈霉菌(Streptomycessp. K-1)。

表1 菌株K-1的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics ofstrain K-1

注：“+”表示為陽性；“-”表示為陰性。

M-Maker; 1-菌株K-1的PCR產(chǎn)物圖1 菌株K-1 16S rDNA的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR product of strain K-1

*參考菌株來源于GenBank數(shù)據(jù)庫，括號內(nèi)為菌株在數(shù)據(jù)庫中的登錄號圖2 菌株K-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain K-1

2.2 菌株共培養(yǎng)降解β-氯氰菊酯的培養(yǎng)基組成確定

不同培養(yǎng)基組成對β-氯氰菊酯降解效果的影響如圖3所示?？梢缘贸?，當培養(yǎng)基為GSM(GSM∶LB=1∶0)和LB(GSM∶LB=0∶1)時，β-氯氰菊酯降解率分別為18.3%和75.3%，而當混合培養(yǎng)基的比例為1∶1(GSM∶LB,v/v)時，β-氯氰菊酯降解率可達80.6%，其原因可能是由于單一培養(yǎng)基中缺乏兩菌株共同生長的營養(yǎng)物質(zhì)[10]。因此，GSM和LB比例為1∶1(v/v)的混合培養(yǎng)基是菌株B-1和菌株K-1共同培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

圖3 培養(yǎng)基組成對菌株共培養(yǎng)降解β-氯氰菊酯的影響Fig.3 Effect of culture compositions on β-CY degradation by co-culture of the strains

2.3 菌株共培養(yǎng)降解β-氯氰菊酯的接種比例確定

兩菌株接種比例對β-氯氰菊酯降解效果的影響如圖4所示。可以得出，當菌株K-1和菌株B-1的接種比例為2∶1(v/v)時，β-氯氰菊酯的降解率可達84.1%，為適宜的接種比例。菌株生存有其適應(yīng)的適度空間，兩菌株混合培養(yǎng)時為奪取生存空間及營養(yǎng)物質(zhì)等資源而相互抑制[4]，且同時接種也會導致兩菌株生長的競爭作用加劇[9]，一定程度上影響了β-氯氰菊酯的降解。

圖4 接種比例對菌株共培養(yǎng)降解β-氯氰菊酯的影響Fig.4 Effect of inoculation ratios on β-CY degradation by co-culture of the strains

2.4 菌株共培養(yǎng)降解β-氯氰菊酯的接種方式確定

菌株接種方式對β-氯氰菊酯降解率的影響如圖5所示。可以得出，3種不同接種方式的β-氯氰菊酯降解率分別為88.3%、72.55%和83.91%，其中接種方式1的降解效果最佳。一般認為，微生物降解目標底物的過程主要發(fā)生在菌體細胞內(nèi)或胞外酶液環(huán)境，但無論哪種過程的目標底物都需與菌體細胞或降解酶發(fā)生直接接觸，即生物吸附作用[11]，且生物吸附先行于生物降解。因此，共培養(yǎng)體系中先接種菌株K-1有利于其生長繁殖和菌絲吸附β-氯氰菊酯，并借助生物膜運輸將β-氯氰菊酯傳送給隨后接入的菌株B-1，使后者更大程度地接觸β-氯氰菊酯，并將其降解[12]。

圖5 接種方式對菌株共培養(yǎng)降解β-氯氰菊酯的影響Fig.5 Effect of inoculation methods on β-CY degradation by co-culture of the strains

2.5 菌株共培養(yǎng)降解β-氯氰菊酯的動力學特征

對適宜條件下菌株共培養(yǎng)降解不同含量β-氯氰菊酯的過程進行動力學分析，依據(jù)得到的動力學方程計算β-氯氰菊酯的降解速率常數(shù)(k)、半衰期(T1/2)和最大比生長速率(Vmax)，結(jié)果見圖6和表2?？梢钥闯觯?～1 d時，β-氯氰菊酯含量緩慢下降，降解速率較低，這是因為接種初期的菌株K-1尚處在生長適應(yīng)期的緣故；1～4 d時，β-氯氰菊酯降解速率明顯增大，這可能是由于菌株K-1的生長形成的菌絲體使加入的菌株B-1更好地接觸并降解β-氯氰菊酯；培養(yǎng)5 d時，不同含量(50、100、200 μg/mL)β-氯氰菊酯的降解率依次為94.0%、85.7%和65.1%。動力學方程的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.95，表明其可較好地反映菌株共培養(yǎng)過程中β-氯氰菊酯含量與培養(yǎng)時間的關(guān)系。

圖6 菌株共培養(yǎng)降解β-氯氰菊酯的動力學曲線Fig.6 Kinetic curves of β-CY degradation by co-culture of the strains

β-氯氰菊酯/(μg·mL-1)動力學方程R2k/d-1T1/2/dVmax/[μg·(mL·d)-1]50Ct=59.04-59.04[0.94/(1+257.63e-2.6252t)]0.996 32.632.400.62100Ct=102.96-102.96[0.90/(1+65.43e-1.5323t)]0.998 51.533.450.34200Ct=210-210[0.60/(1+75.25e-1.7584t)]0.999 01.7612.290.26

3 結(jié)論

從長期噴施擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的菜園土壤中篩選得到1株對β-氯氰菊酯具有較強降解能力的放線菌，根據(jù)生理生化特征及16S rDNA測序結(jié)果鑒定其為鏈霉菌(Streptomycessp. K-1)。適宜條件下，鏈霉菌K-1與地衣芽孢桿菌B-1共培養(yǎng)對β-氯氰菊酯的降解率較之單獨使用地衣芽孢桿菌B-1提高了11.3%，表明2菌株共培養(yǎng)更有利于β-氯氰菊酯的降解。研究結(jié)果可為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥污染農(nóng)作物土壤的修復(fù)和減少農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留途徑提供參考依據(jù)。