羊乳制品中牛乳成分的熒光定量PCR檢測方法研究

宋宏新，劉建蘭，徐丹，徐秦峰

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安，710021)

與牛乳相比，羊乳風(fēng)味獨特，營養(yǎng)素組成更平衡，脂肪球小，更利于人體吸收[1]。羊乳價格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于牛乳，在經(jīng)濟利益的驅(qū)動下，不法分子會在羊乳產(chǎn)品中摻入牛乳，甚至用牛奶粉冒充羊奶粉。乳制品摻假的安全性檢測是保障消費者權(quán)益的重要手段[2]。

目前關(guān)于羊乳中摻入牛乳源性成分的檢測多是以乳中含量較高的脂肪和蛋白質(zhì)為檢測目標(biāo)[3]，常用方法有光譜檢測技術(shù)[3]、色譜技術(shù)[5]、免疫學(xué)技術(shù)[6]、電泳技術(shù)[7]等。光譜技術(shù)幾乎無需對樣品預(yù)處理且容易操作，但需要建立復(fù)雜的模型，難以推廣使用[8]。色譜技術(shù)依據(jù)牛羊乳脂肪差異成分的穩(wěn)定性不足，需要進(jìn)一步探究[9-10]。免疫學(xué)技術(shù)易發(fā)生假陽性且抗體不易保存[11]，蛋白質(zhì)電泳技術(shù)由于熱加工引起的蛋白質(zhì)變性損失較大，檢驗摻假成分的準(zhǔn)確性難以保證[12]。由于DNA的種屬特異性以及對食品加工具有更好的穩(wěn)定性，基于DNA水平的PCR檢測方法可以克服以上技術(shù)的不足，被越來越多地應(yīng)用于乳制品的摻假鑒別檢測中。已有的報道通常采用瓊脂糖凝膠電泳[13-14]和實時熒光檢測法[15]鑒定牛屬PCR擴增產(chǎn)物是否存在，用于確定羊乳制品是否含有牛乳成分。相比于凝膠電泳檢測，實時熒光法不僅操作簡單快捷、樣品通量高，還避免了開蓋帶來的污染，然而大多數(shù)實時熒光法采用的是探針法[1, 9, 16-17]，需要對不同的靶序列合成不同的探針，原料成本較高。

本研究旨在利用經(jīng)濟實惠的DNA結(jié)合染料，建立基于染料的實時熒光PCR法用于羊乳制品中牛乳成分的摻假鑒別檢測。通過磁珠法提取牛羊乳及其制品中的DNA，以牛羊的線粒體12S rRNA基因的保守序列為靶基因設(shè)計合成兩對特異性引物進(jìn)行實時擴增和檢測，最后用熔解曲線來確認(rèn)PCR擴增反應(yīng)的特異性，具有快速、省時、成本低、靈敏度高的特點。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

鮮牛乳樣品采自西安市未央?yún)^(qū)草灘奶牛場；鮮羊乳采自陜西省富平縣金牛乳品公司；鮮乳于-20 ℃保存?zhèn)溆?，以此作為通用性及特異性的檢測。其他液態(tài)乳、全脂奶粉、脫脂奶粉及配方奶粉等市售奶類多個品牌的樣品購自西安市不同的超市，用于驗證方法的實際應(yīng)用價值。

模擬摻假樣品的制備：以鮮羊乳中分別摻入50%、10%、5%、2.5%、1%、0.5%和0.1%的新鮮牛乳的新鮮羊乳為模擬摻假樣品。

1.1.2 主要儀器與試劑

儀器：實時熒光定量PCR儀(Qtower 2.2)，德國耶拿公司；紫外可見分光光度計(Agilent Cary 5000)，安捷倫科技有限公司；瓊脂糖水平電泳儀(DYCP-31DN)，北京六一生物科技有限公司；電泳圖像分析系統(tǒng)(FR-980A)，上海復(fù)日科技有限公司。

試劑：PCR引物，上海生工生物工程有限公司合成；2×Super Real Pre Mix PCR Mix Plus(含SYBR Green I染料)、磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA Marker，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫脂樣品的制備

采用黎穎等[14]對乳的除脂方法，并略有修改。取10.0 mL解凍混勻樣品于Eppendorf管中(固體乳粉則稱量40.0 mg，溶于10.0 mL蒸餾水中，混勻，靜置24 h使其充分復(fù)原)，在4 ℃ 5 000×g離心30 min，棄去上層乳脂后將乳混勻，10 000×g離心15 min，再次除去上層乳脂，如此重復(fù)2次，棄去上清液，保留最底部的沉淀，用2 mL的PBS緩沖液溶解懸浮，10 000×g離心10 min，如此重復(fù)3次。將最后所得沉淀溶于500 μL PBS緩沖液中懸浮(固體樣品最終溶于200 μL PBS緩沖液中)，備用。

1.2.2 DNA的提取及質(zhì)量濃度的測定

取脫脂后的樣品400 μL加至1.5 mL Eppendorf管中，首先加入40 μL Proteinase K和600 μL裂解液在65 ℃下反應(yīng)15 min，用以消化蛋白、裂解細(xì)胞并滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶；隨后加入700 μL異丙醇以去除多糖和雜蛋白釋放核酸，進(jìn)而加入40 μL磁珠懸浮液特異性吸附核酸；磁分離后分別加入1.4 mL緩沖液和1.4 mL漂洗液充分清洗磁珠去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)和純化核酸；最后用洗脫緩沖液60 μL將DNA從磁珠上洗脫，轉(zhuǎn)移至一個新的離心管中，并于4 ℃保存。通過測定鮮牛乳、鮮羊乳DNA提取液在260 nm處的吸光度值，經(jīng)計算可得模板DNA的質(zhì)量濃度分別為0.963 μg/mL和0.872 μg/mL。

1.2.3 引物的設(shè)計

采用Primer Premier 6.0引物設(shè)計軟件，經(jīng)BLAST比對后選取保守區(qū)域設(shè)計不同牛羊源性引物。引物序列見表1。

表1 本實驗中PCR擴增引物序列Table 1 Oligonucleotides used as PCR primers

1.2.4 熒光定量PCR反應(yīng)

對退火溫度、引物濃度以及循環(huán)數(shù)等實驗條件進(jìn)行了優(yōu)化，熒光定量PCR反應(yīng)溶液確定為?；蜓虻纳舷掠我锔?.5 μL (10 μmol/L)，10 μL 2×Super Real Pre Mix PCR Mix Plus，2 μL模板DNA，超純水補至20 μL；PCR反應(yīng)程序為，95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；72 ℃后延伸5 min。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳

取熒光定量PCR擴增后產(chǎn)物6 μL，加入0.5 μL SYBR Green染料(100×)和1 μL 6×上樣緩沖液，混勻為待測樣品。配制2.5%瓊脂糖凝膠，調(diào)整電泳儀電壓至100 V，電泳約60 min，置電泳圖像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳DNA中牛、羊源性成分的特異性檢測

選取線粒體12S rRNA基因設(shè)計牛、羊的特異性引物，主要是因為線粒體DNA在物種間的變異大，并且其在細(xì)胞中的拷貝數(shù)多于核基因組DNA[18-19]。此外，考慮到乳品加工處理對DNA的降解，目的基因擴增片段均小于200 bp。以使用磁珠從牛、羊乳中提取的DNA作為模板，分別加入牛羊特異性引物，進(jìn)行熒光定量PCR擴增實驗(圖1-a)。

a-熒光定量PCR;b-瓊脂糖電泳;1-羊引物；2-羊引物+牛乳DNA；3-羊引物+羊乳DNA；4-牛引物；5-牛引物+羊乳DNA；6-牛引物+牛乳DNA；M-DNA Marker圖1 牛、羊引物特異性的驗證Fig.1 Verification of specificity of bovine and goat primers using real time PCR (a) or gel electrophoresis (b)

實驗結(jié)果表明，只有在牛引物中加入牛模板、羊引物中加入羊模板才能觀察到明顯的實時熒光PCR擴增曲線(曲線6和曲線3)，而沒有模板或者交叉加入模板時均無明顯的擴增信號，具體到Ct數(shù)值上它們之間均相差10個以上(Ct值分別為30.59和31.21)，說明設(shè)計的引物對于牛羊源性檢測具有較好的特異性。根據(jù)DRUMMOND等[9]對乳制品摻假的研究，無模板DNA的Ct值在高于31時，判定為無交叉反應(yīng)，即為陰性。對比該研究，圖1中，可以發(fā)生交叉反應(yīng)之前的Ct值可以作為摻假檢測的判定方式，即Ct值小于30，為陽性結(jié)果，反之，則為陰性。由于DNA結(jié)合染料SYBR Green I能夠結(jié)合所有的雙鏈DNA，我們進(jìn)行了熔鏈曲線分析，以確認(rèn)擴增產(chǎn)物的特異性。實驗結(jié)果表明，PCR擴增中并無引物二聚體以及其他非特異的反應(yīng)產(chǎn)物(圖1-a插圖)。進(jìn)一步的凝膠電泳結(jié)果顯示，只有牛、羊乳DNA中分別加入牛、羊特異性引物才出現(xiàn)明顯的擴增條帶(圖1-b 泳道6和3)，與實時熒光PCR實驗結(jié)果一致；并且牛羊PCR片段大小分別為153 bp和118 bp，與預(yù)期符合，從而驗證PCR擴增出了特異性片段。此外，PCR擴增DNA序列的正確性也通過測序進(jìn)行了驗證(測序結(jié)果未給出)。初步的實驗結(jié)果驗證了牛、羊引物的特異性，因此所建立的基于DNA結(jié)合染料(SYBR Green I)的實時熒光定量PCR方法，可以用于乳DNA中牛、羊源性成分的特異性檢測。

2.2 熒光定量PCR對牛、羊乳DNA檢測的靈敏度

為了確定實時PCR方法能夠檢測到的牛、羊乳DNA最低含量，以及計算PCR擴增反應(yīng)的效率，將提取出牛羊乳DNA稀釋成一系列濃度梯度進(jìn)行熒光PCR實驗。實驗結(jié)果如圖2所示，牛、羊源性DNA成分檢測分別能達(dá)到10-5和10-4模板稀釋度，表明檢測體系具有較高的檢測靈敏度和較寬的動態(tài)范圍。進(jìn)一步計算可得牛、羊乳DNA檢測體系PCR擴增效率分別為90.7%和103.9%，均在理想擴增效率90%～105%，且線性相關(guān)系數(shù)R2>0.98[20]，表明PCR引物設(shè)計合理，實時PCR擴增實驗在優(yōu)化的反應(yīng)條件下具有較好的重復(fù)性和適用性。

為了驗證方法的應(yīng)用性，將牛乳DNA分別以0.01%，0.05%，0.1%，1.0%，10%，50%的比例摻入到羊乳DNA中。當(dāng)牛乳DNA含量低至0.05%時，實時熒光定量PCR體系仍有明顯的特異性擴增信號(圖3-a)，說明本方法對牛乳DNA摻入羊乳DNA的摻假檢測限為0.05%。

a-牛乳DNA；b-羊乳DNA圖2 牛羊乳DNA檢測的實時熒光PCR曲線和線性范圍Fig.2 Quantitation profiles and linearity (inset) of the real-timePCR assays for bovine (a) and goat (b) DNA extracts

2.3 模擬羊乳樣品中牛乳摻入比例檢測

考慮羊乳制品摻假市面上多直接將牛乳摻入羊乳的情況，為了精確判定其檢測的最低限值并確認(rèn)該方法對產(chǎn)品的實際應(yīng)用性，故羊乳預(yù)先以不同比例混入牛乳設(shè)定為實際模擬摻假樣品。實驗結(jié)果如圖3-b所示，最低能檢測出摻入2.5%牛乳的模擬摻假樣品，明顯低于牛羊乳DNA直接混合的檢出限，這是因為乳體系的復(fù)雜性和乳體細(xì)胞分布的不均勻性，在乳直接混和及提取DNA時會有部分的損失。盡管最低檢出限高于采用探針法的實時熒光定量PCR方法[14, 21]，但是基于熒光染料的實時PCR方法檢測成本更低，并且實際生產(chǎn)中從利潤與風(fēng)險的綜合因素考慮，摻假牛乳比例一般高于5%才有可觀的經(jīng)濟利益，因此本方法滿足實際樣品的檢測需要。

a-乳DNA混合樣品；b-乳混合樣品圖3 羊乳中牛源性成分的熒光定量PCR檢測Fig.3 Real-time PCR detection of ingredients derived from bovine in goat milk注：圖a中牛羊乳DNA比例分別為100%，50%, 10%, 1.0%,0.1%,0.05%,0.01%和0%；圖b中牛羊乳比例分別為100%,50%,10%,5%,2.5%和0%。

2.4 市售羊乳制品中羊、牛源性成分的同時鑒定

為了驗證方法的實用價值，使用純羊奶粉與純牛奶粉分別作陽性和陰性對照，選取市售不同品牌的全脂奶粉、脫脂奶粉、淡奶粉及嬰幼兒配方奶粉等11個羊奶粉樣品，分別以牛、羊特異性引物對這些樣品的羊、牛源性成分進(jìn)行檢測。由圖1的判定結(jié)果結(jié)合圖3的檢出限以及表2的對照樣品的Ct值，結(jié)果顯示，8個純羊乳樣品中，僅樣品2、5、8顯示了與標(biāo)簽一致的純羊乳；樣品1、6、7則顯示了幾乎為純牛乳，與標(biāo)簽不符；其余樣品則顯示了在羊乳中不同程度的摻入牛乳成分。盡管在配方奶粉中是允許加牛乳清粉，但是樣品11則顯示了幾乎沒有羊乳的片段擴增出來，與標(biāo)識的主成分不相符。因此，所建立的實時熒光PCR方法可以檢測出市售羊乳制品中牛乳源性摻假的商品。此外，從熒光定量PCR對于羊乳制品DNA的檢測也可以看出，奶粉經(jīng)過均質(zhì)、巴氏殺菌、噴霧干燥等一系列的加工操作，說明DNA在高溫高壓處理下依然能夠穩(wěn)定存在[22-23]，且由于選取DNA片段較小，不易受加工變化而造成損失[24]，與之相比蛋白質(zhì)標(biāo)志物則有明顯降解[25]，因此以DNA差異作為羊乳摻假鑒別檢測的基本依據(jù)，其準(zhǔn)確性更高。

3 結(jié)論

本論文依據(jù)牛羊線粒體基因的差異設(shè)計了特異性引物，建立了快速鑒別羊乳摻假的實時熒光定量PCR方法，并成功的應(yīng)用于市售羊乳制品的鑒別檢測。以線粒體12S rRNA保守序列設(shè)計的引物PCR特異性好，避免了交叉反應(yīng)及假陽性現(xiàn)象的發(fā)生，且擴增DNA片段較小不易受加工影響。以不同比例純DNA混合摻比，最低可檢測達(dá)0.05%的牛乳摻入比例，說明該方法的靈敏度高，可行性好。商業(yè)摻假從利潤與風(fēng)險的綜合因素考慮，以5%摻假為閾值，本方法可以檢測出摻入2.5%牛乳的羊乳比例，滿足羊乳制品摻假檢測的實際需要。與采用凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物用于羊乳摻假檢測的PCR方法相比，基于染料的熒光實時PCR方法減少開蓋造成的PCR污染風(fēng)險，并且操作簡單、快速、樣品通量高；與采用探針法的熒光實時PCR方法相比，DNA結(jié)合染料成本低，不需要為待檢的靶序列設(shè)計合成昂貴的標(biāo)記探針。通過對市售羊乳及其制品中摻假牛乳成分的檢測，證明該方法可以適應(yīng)鮮羊乳原料、加工液態(tài)乳及各種乳粉，方法的適用性好，可以食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗部門對于羊乳摻假牛乳檢測提供一定的技術(shù)參考。

表2 市售羊乳制品中羊、牛乳成分的熒光定量PCR檢測Table 2 Identification of goat and bovine milk components in goat dairy products using real-time PCR

注：以Ct=30作為判據(jù)，<30表示該DNA成分檢出，記為+；>30表示該DNA成分未檢出，記為-。