新型結(jié)核病疫苗菌株(B/R菌株)對T細(xì)胞免疫記憶的建立及保護(hù)效應(yīng)的研究

邵 萌，吳 芳，張 杰，董江濤，吳江東，柳小玲，章 樂，趙海軍，張萬江

結(jié)核病(TB)是世界范圍內(nèi)單一致病菌導(dǎo)致死亡率最高的慢性傳染性疾病，約有1/4的人口感染了結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)。2019年全球結(jié)核病報(bào)告顯示，2018年結(jié)核病死亡人數(shù)較2017年降低了150萬，但仍有1 000萬新發(fā)病例，且各國的發(fā)病率差別很大，從每年每10萬人不足5例到超過500例，全球平均水平約為130例，其中負(fù)擔(dān)最重的為青壯年人群，所占比例高達(dá)89%[1]。目前預(yù)防結(jié)核病唯一廣泛使用的疫苗是1921年問世的卡介苗(以下簡稱BCG)，研究證明，BCG的保護(hù)期只有10至15年，這可能解釋了TB的發(fā)病人群主要是青壯年[2]，且隨著BCG不斷的傳代及接種后時(shí)間的延長，其保護(hù)作用逐漸減弱[3]，也與BCG RD1和RD2區(qū)域編碼的重要抗原缺失有關(guān)[4]，加上結(jié)核病的診斷和耐藥結(jié)核病治療面臨的挑戰(zhàn)，迫切需要一種比BCG更有效的疫苗預(yù)防結(jié)核病。

本課題組前期利用原生質(zhì)體技術(shù)及電穿孔技術(shù)，以BCG和結(jié)核分枝桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)無毒株H37Ra菌株(以下簡稱H37Ra菌株)為親本，構(gòu)建及選育的新型結(jié)核病疫苗菌株B/R菌株[5](以下簡稱B/R菌株)在使用的安全性、毒性、定植能力及傳代穩(wěn)定性方面表現(xiàn)出較好的候選結(jié)核病疫苗的潛能。疫苗接種的終極目標(biāo)是能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效且長久的免疫保護(hù)力，這種保護(hù)依賴于穩(wěn)定的免疫記憶的建立及維持[6]。因此，研究免疫記憶特征將對新型結(jié)核病疫苗的設(shè)計(jì)和評價(jià)具有重要意義。

本研究將以B/R菌株為研究對象，比較研究BCG、H37Ra和B/R菌株分別免疫小鼠后，對T細(xì)胞免疫記憶建立的影響，探討B(tài)/R菌株作為結(jié)核病疫苗菌株的短期免疫保護(hù)效果，為B/R菌株作為新型結(jié)核病疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種 BCG和H37Ra菌株由中國食品藥品檢定研究院提供，B/R菌株由本研究室構(gòu)建，－80℃保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 6～8周齡，健康雌性C57BL/6小鼠，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心。所有研究按國家實(shí)驗(yàn)動物學(xué)會的指導(dǎo)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)方案通過石河子大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.1.3 主要試劑 Mouse IFN-γELISA Kit，Mouse IL-2 ELISA Kit購自杭州聯(lián)科生物公司，小鼠脾臟淋巴分離液購自天津?yàn)蠊?，Anti-Mouse CD4PE-Cy5、Anti-Human/Mouse CD44FITC、Anti-Mouse CD62L PE、Anti-Mouse CD8a PE-Cy5購自eBioscience公司，7 H11干粉和OADC購自BD Phar mingen公司。

1.2 方 法

1.2.1 菌株培養(yǎng)和菌懸液制備 取出并解凍保存的BCG、H37Ra菌株及B/R菌株，在生物安全柜中將各菌株分別接種至新鮮制備的無菌改良羅氏固體培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)3周后，取適量菌株至細(xì)菌研磨管中研磨、稀釋、比濁儀檢測細(xì)菌濃度，最后將細(xì)菌濃度調(diào)整為1×107cf u/mL。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及免疫 將64只小鼠隨機(jī)分為4組即PBS組、BCG組、H37Ra組和B/R組，其中36只用于免疫記憶水平的檢測(每組9只)，另外28只用于比較各菌株的短期保護(hù)效應(yīng)(每組7只)。各取0.1 mL菌懸液(含菌量為1.0×106cf u/mL)，用背部皮下注射方式無菌免疫相應(yīng)各組小鼠，免疫1次[7-8]，PBS組注射等體積的PBS。

1.2.3 ELISA檢測血清中IL-2和IFN-γ的水平分別在免疫小鼠后8周、12周和16周，每組取3只小鼠，眼球取血，將收取的小鼠外周血靜置30 min后低溫3 500 r/min離心10 min，收集血清，分裝－80℃保存。最后將所有時(shí)間點(diǎn)的各組血清，依據(jù)IL-2和IFN-γ的ELSA試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在波長450 n m處檢測OD值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫記憶性淋巴細(xì)胞的分型及水平 在小鼠免疫后8周、12周和16周，小鼠眼球取血后，于無菌條件下提取各組小鼠的脾細(xì)胞，用移液器混勻并將脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，補(bǔ)充PBS至8 mL，混勻，4℃1 500 r/min離心10 min，棄上清;加3 mL PBS混勻，并將其緩慢加入另一盛有5 mL小鼠淋巴分離液的玻璃試管中，低速離心機(jī)，1 000 r/min，離心30 min;吸出淋巴細(xì)胞層，加PBS至8 mL，4℃1 500 r/min離心5 min，棄上清，2次;1 mL PBS重懸脾淋巴細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色觀察活細(xì)胞率98%，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)，取100μL至各組離心管中，加入CD4/CD8a PE-Cy5、CD44FITC、CD62LPE熒光標(biāo)記抗體(eBioscience，USA)，4℃避光孵育30 min;加1 mL PBS離心5 min，棄上清，2次;最后加300μL PBS重懸細(xì)胞準(zhǔn)備上機(jī)檢測，同時(shí)設(shè)置空白管，單標(biāo)管。

結(jié)果分析時(shí)先以淋巴細(xì)胞設(shè)P1門，再分別以CD4＋、CD8＋細(xì)胞設(shè)P2門，以 CD62L，CD44的表達(dá)為分選標(biāo)記檢測TCM(CD62Lhi，CD44hi)及TEM(CD62Llo，CD44hi)的水平。

1.2.5 蘇木素伊紅染色(HE染色)及CFU計(jì)數(shù)評價(jià)免疫保護(hù)效果 小鼠免疫后8周，用減毒牛結(jié)核分枝桿菌BCG(5×106cf u/只)通過腹腔注射方式感染小鼠，攻擊后4周，每組取7只小鼠，其中3只小鼠肺臟做組織病理學(xué)分析，即取肺臟觀察整體病理變化，并保存在4%多聚甲醛溶液中固定72 h后進(jìn)行組織石蠟包埋、切片、烤片，用于HE染色。組織的病理損傷程度通過單盲法由病理醫(yī)生進(jìn)行觀察分析。每組其余4只做臟器菌落數(shù)計(jì)算，即無菌條件下取脾臟和肺臟分別置于研缽中充分研磨，加入含0.05%Tween80的無菌PBS(PBS-T)做倍比稀釋，振蕩器混勻，取3個(gè)稀釋度的菌液100μL分別涂布于含10%OADC的7 H11培養(yǎng)基上，37℃恒溫倒置培養(yǎng)4周后計(jì)算各組脾和肺臟的cf u，結(jié)果以Log10cf u比較分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 用Graph Pad Pris m 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(ANOVA)的方法進(jìn)行多組間比較，使用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行事后兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平 ELISA檢測結(jié)果顯示，免疫小鼠8、12、16周，PBS對照組小鼠血清中的IL-2(F＝3.183，P＜0.05)、IFN-γ(F＝12.27，P＜0.05)水平均顯著低于實(shí)驗(yàn)組。免疫小鼠8周，B/R菌株組小鼠血清中IL-2(q＝4.709，P＜0.05))、IFN-γ(q＝5.477，P＜0.05)水平均高于BCG組，與H37Ra組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫小鼠12周，B/R菌株組小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平與BCG組和H37 Ra組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫小鼠16周，B/R菌株組小鼠血清IFN-γ水平高于BCG組(q＝4.243，P＜0.05)，與H37Ra組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;B/R菌株組小鼠血清IL-2水平與BCG組和H37Ra組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫小鼠8、12、16周，隨時(shí)間延長，B/R菌株組，小鼠血清IFN-γ呈下降趨勢，但血清IL-2一直維持較高水平(表1，表2)。

表1 免疫后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清中IL-2(pg/mL)的表達(dá)水平Tab.1 Levels of IL-2(pg/mL)in seru m of mice at different times after immunization

表2 免疫后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清中IFN-γ(pg/mL)的表達(dá)水平Tab.2 Levels of IFN-γ(pg/mL)in serum of mice at different times after immunization

2.2 免疫后，T細(xì)胞免疫記憶的時(shí)相性變化 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，免疫小鼠8、12、16周，對于CD4＋T細(xì)胞，PBS組的TCM和TEM的數(shù)量均最低，這與我們預(yù)期結(jié)果相一致。隨免疫時(shí)間的延長，B/R菌株組的TCM，在12周時(shí)低于BCG組(q＝5.25，P＜0.05)和 H37Ra組(q＝6.132，P＜0.05)，但其TCM在16周時(shí)維持與BCG相當(dāng)?shù)乃?TEM的數(shù)量在8，12周時(shí)與BCG組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在16周時(shí)顯著高于BCG組(q＝31.5，P＜0.05)(圖1)。免疫小鼠8、12、16周，對于CD8＋T細(xì)胞，與PBS組相比較，除12周時(shí)B/R菌株組的TCM有所降低外，B/R菌株組均產(chǎn)生了高于PBS組的TCM(F＝16.86，P＜0.05)和TEM(F＝27.93，P＜0.05)。隨免疫時(shí)間的延長，B/R組的TCM維持與BCG相當(dāng)?shù)乃?TEM的數(shù)量在8周時(shí)與BCG組和H37Ra組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在12周時(shí)顯著高于BCG組(q＝15.5，P＜0.05)和 H37Ra組(q＝12.97，P＜0.05)，且較早期水平更高。16周時(shí)，B/R菌株組的TEM，數(shù)量仍高于BCG組(q＝16.08，P＜0.05)和 H37Ra組(q＝20.7，P＜0.05)(圖2)。

圖1 免疫后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠脾細(xì)胞中CD4＋記憶性T細(xì)胞亞群的變化Fig.1 Changes of CD4＋TM subsets in mouse spleen cells of each group at different times after immunization

2.3 各菌株免疫小鼠后短期保護(hù)效果的評價(jià)BCG攻擊后4周，各組肺臟大體上未觀察到明顯病理變化。肺臟HE染色結(jié)果顯示，PBS組的肺組織病理學(xué)改變最嚴(yán)重，鏡下可見病變累及面積較大，肺泡結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重并融合成片，上皮樣細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤較多，肺內(nèi)出血，肺泡炎。與PBS組比，H37Ra組小鼠的病理變化相似，但肺泡結(jié)構(gòu)損傷不嚴(yán)重，肺內(nèi)出血有所減少，肺泡間隔增厚，炎性細(xì)胞浸潤仍然較多。值得注意的是，與H37 Ra組比，B/R菌株組的病理損傷程度明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)正常，紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞滲出減少，大部分肺泡腔清晰，并與在接種了BCG的小鼠中觀察的結(jié)果相似(圖3)。CFU結(jié)果顯示，PBS組脾和肺組織中的菌落數(shù)最高。B/R菌株組中脾(q＝11.64，P＜0.05)和肺(q＝17.0，P＜0.05)的載菌量比PBS組顯著降低，與BCG組結(jié)果相似(圖4，圖5)。

圖2 免疫后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠脾細(xì)胞中CD8＋記憶性T細(xì)胞亞群的變化Fig.2 Changes of CD8＋TM subsets in mouse spleen cells of each group at different times after immunization

圖3 各組小鼠肺組織蘇木素伊紅染色(HE染色)結(jié)果Fig.3 Results of hematoxylin and eosin staining(HE)in lung tissue,(100×)

3 討 論

機(jī)體在抗M.tuberculosis感染過程中，免疫細(xì)胞釋放的多種特異性細(xì)胞因子可啟動殺菌機(jī)制，IL-2和IFN-γ是其中的代表因子。研究發(fā)現(xiàn)IL-2可激活體內(nèi)的CD4＋T細(xì)胞并與維持機(jī)體長期的生存率相關(guān)[9]。在我們的研究結(jié)果中，小鼠免疫后的8至16周，B/R菌株組血清中的IL-2顯著高于PBS組，與BCG組相當(dāng)，并可穩(wěn)定保持較高水平，此外，這與記憶性T淋巴細(xì)胞維持較高水平的結(jié)果相一致，提示IL-2可能有助于機(jī)體記憶細(xì)胞的維持。雖然目前還不清楚IL-2水平的增加是否與疫苗更高的保護(hù)效力相關(guān)，但I(xiàn)L-2水平的升高已被證明與CD8＋記憶性T細(xì)胞的生成有關(guān)[10]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)記憶性T細(xì)胞(TM)存在異質(zhì)性，TCM可分泌較高水平的IL-2，TEM分泌IFN-γ的能力相對較強(qiáng)[11]。IFN-γ有助于單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的募集，并激活巨噬細(xì)胞的抗菌活性，防止TM的耗竭[12]。本結(jié)果中，隨時(shí)間延長，各疫苗組血清中IFN-γ的水平整體有減弱跡象，但與PBS組比，疫苗組血清中IFN-γ的水平是顯著升高的，說明各疫苗組均可刺激小鼠機(jī)體釋放免疫保護(hù)因子。其中，16周時(shí)，B/R菌株血清IFN-γ的水平高于BCG組，這與16周時(shí)B/R菌株組產(chǎn)生TEM水平高于BCG組TEM水平的結(jié)果相一致。

圖4 各組小鼠脾組織中的菌落數(shù)(CFU)Fig.4 CFUin spleen tissue of mice in each group

圖5 各組小鼠肺臟組織中的菌落數(shù)(CFU)Fig.5 Colony count(CFU)in lung tissue of mice in each group

對于慢性感染性疾病，機(jī)體的免疫記憶主要由記憶性T淋巴細(xì)胞負(fù)責(zé)，免疫記憶細(xì)胞具有干細(xì)胞樣自我更新的能力，可長期存在，從而保護(hù)機(jī)體免受相同病原的入侵[13-14]。本研究中，我們用流式細(xì)胞術(shù)比較不同疫苗免疫小鼠后，在不同時(shí)間點(diǎn)對記憶性T細(xì)胞反應(yīng)的影響。我們的檢測結(jié)果顯示，CD4＋和CD8＋的記憶細(xì)胞分群有所不同，這與Stephen Abolins等人的研究結(jié)果一致[15]。免疫后8、12、16周，除12周時(shí)CD8＋TCM有所降低外，B/R菌株組誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4＋、CD8＋T細(xì)胞中TCM及TEM數(shù)均顯著高于PBS組。說明給小鼠接種B/R菌株后能刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的免疫記憶。研究證明，當(dāng)抗原重復(fù)暴露時(shí)，TCM的增殖能力強(qiáng)于TEM，并可迅速分化為效應(yīng)T細(xì)胞和TEM，介導(dǎo)長期的免疫保護(hù)[16]。從結(jié)果中我們注意到，12周時(shí)B/R菌株組的CD4＋、CD8＋TCM的水平較其他疫苗組有所下降，而此時(shí)的TEM卻相對其他疫苗組有所升高，我們考慮這種現(xiàn)象與B/R菌株組刺激脾臟中TCM分化成較多的TEM有關(guān)。此外，12周時(shí)B/R菌株組CD8＋TCM低于正常水平，到了16周時(shí)又恢復(fù)到較高水平，而CD8＋TEM的比例卻相對較高，可能是此時(shí)機(jī)體對CD8＋TCM的調(diào)節(jié)尚未穩(wěn)定。CD4＋Th1細(xì)胞在抗結(jié)核病中起核心作用，并可影響CD8＋記憶細(xì)胞的分化[17-18]。目前，CD8＋T記憶細(xì)胞在抗慢性感染性疾病中的作用也日益突顯，它可阻止體內(nèi)潛伏M.tubercul osis的再激活[19]，對再次入侵的病原可快速啟動免疫應(yīng)答，通過分泌穿孔素、顆粒酶等直接殺死胞內(nèi)寄生的M.tubercul osis[20]，也可啟動凋亡相關(guān)信號通路，介導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡[21]。一個(gè)驚喜的發(fā)現(xiàn)是，無論是CD4＋T細(xì)胞還是CD8＋T細(xì)胞，與BCG和H37Ra組比，隨免疫時(shí)間延長，B/R菌株組均可維持更高水平的TEM，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尤其是以CD8＋TEM細(xì)胞表現(xiàn)更為明顯，提示B/R菌株在免疫記憶特征方面，隨免疫后時(shí)間的推移，較其親本BCG和H37Ra菌株可能更具有一定的優(yōu)勢。造成這種差異的原因:一方面與菌株來源的種類有關(guān)，另一方面考慮與不同菌株含有的抗原豐富度有關(guān)。B/R菌株含有雙親菌株高頻率重組的基因，可能表達(dá)種類多樣的抗原。研究表明，抗原表達(dá)的豐富度和持續(xù)時(shí)間決定了小鼠和人類T細(xì)胞的功能[22]。另有研究發(fā)現(xiàn)，記憶性T細(xì)胞來源于效應(yīng)T細(xì)胞[23]，而抗原刺激會通過影響影響T細(xì)胞的代謝水平進(jìn)而影響效應(yīng)記憶T細(xì)胞的命運(yùn)[24-25]。因此，我們猜想B/R菌株能夠刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生更多的TEM可能與其本身是由原生質(zhì)體融合形成的融合細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有關(guān)，具體機(jī)制以及對其蛋白組學(xué)的檢測分析也將是我們進(jìn)一步探究的方向。

B/R菌株免疫小鼠后刺激機(jī)體建立的免疫記憶是否能真正起到抗M.tuberculosis感染的效果我們還不確定，因此，我們初步探究了用BCG攻擊各組小鼠后各菌株的短期保護(hù)效果。通過觀察臟器的病理改變及計(jì)算菌落數(shù)是評價(jià)疫苗保護(hù)效果的客觀指標(biāo)[26]。本實(shí)驗(yàn)中，B/R菌株組的肺組織病理損傷程度以及脾肺器菌落數(shù)較PBS組顯著降低，與BCG組比無差異，結(jié)合CD4＋、CD8＋記憶細(xì)胞及血清中IL-2和IFN-γ的檢測結(jié)果，提示B/R菌株對機(jī)體的免疫保護(hù)性可能與免疫記憶的建立有關(guān)，其短期免疫保護(hù)效果與BCG相當(dāng)。由于生物安全設(shè)備的限制，我們選擇BCG感染小鼠來研究免疫保護(hù)效果，存在一定的局限性，可能缺乏說服力，但用來評價(jià)結(jié)核病疫苗誘導(dǎo)的免疫記憶是可行的[27]。

綜上所述，我們的研究揭示，B/R菌株繼承了親代BCG和H37Ra菌株的優(yōu)勢，即免疫小鼠后可建立較高水平的免疫記憶，以TEM為主，其免疫記憶水平可維持近數(shù)月，同時(shí)具有較好的短期免疫保護(hù)效果，為B/R菌株作為較好的候選結(jié)核病疫苗提供了理論依據(jù)。36(8):611-617.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.101