HPLC同時(shí)測(cè)定附子理中丸（大蜜丸）中果糖和葡萄糖的含量

武紅娜，王曉琦，潘海霞

（滄州市食品藥品檢驗(yàn)所，河北 滄州 061000）

附子理中丸是甲類(lèi)非處方藥，出自宋代《惠民藥局方》，具有溫中健脾的功效，用于脾胃虛寒、脘腹冷痛、手足不溫等癥[1-4]，臨床應(yīng)用廣泛。目前，附子理中丸有大蜜丸、小蜜丸、水蜜丸和濃縮丸4種劑型，其中大蜜丸、小蜜丸和水蜜丸3種劑型均收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部 ，由附子（制）、干姜、炒白術(shù)、黨參和甘草5味藥加煉蜜制成[1]。

煉蜜是由蜂蜜煉制而成，作為蜜丸中常用的輔料，據(jù)調(diào)查目前市場(chǎng)上不排除存在劣質(zhì)蜂蜜制丸的現(xiàn)象[5-6]。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)輔料蜂蜜質(zhì)量進(jìn)行控制，故擬建立高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定附子理中丸（大蜜丸）輔料蜂蜜中葡萄糖和果糖成分，以期為附子理中丸及同類(lèi)藥品的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC20AT型 HPLC儀，RID-10A檢測(cè)器（日本島津公司）；LC350A型超聲波處理器（濟(jì)寧市魯超儀器有限公司）；CP225D型十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）； Milli-Q Advantage A10型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試劑與試藥

果糖對(duì)照品（批號(hào)：100231-201807），D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)110833-201707，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；乙腈（色譜純），醋酸（色譜純），磷酸（純度85 %，默克公司）；其他試劑均為分析純，水為純化水（自制）。附子理中丸（大蜜丸）15批次，來(lái)自我省11個(gè)地市，產(chǎn)自全國(guó)各地不同企業(yè)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動(dòng)相：乙腈-水（85:15），流速0.8 ml/min，以Prevail Carbohyrate ES為色譜柱，柱溫25 ℃，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。理進(jìn)樣體積15 μl。理論板數(shù)：按果糖峰計(jì)應(yīng)不低于2000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照溶液的制備 取果糖、D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加40 %乙腈，分別制成每1 ml含果糖15 mg、D-無(wú)水葡萄糖16 mg的溶液，搖勻，濾過(guò)，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品剪碎，取約2.0 g，精密稱(chēng)定；置具塞錐形瓶中，精密加入40 %乙腈50 ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理20 min，放冷，用40 %乙腈補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按附子理中丸的處方比例和生產(chǎn)工藝制備缺煉蜜的陰性樣品，并按2.2.1項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜（見(jiàn)圖1）。由圖1可見(jiàn)，供試品溶液主峰與對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間一致，陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾，說(shuō)明本方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 HPLC圖譜

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別配制果糖、D-無(wú)水葡萄糖系列濃度混合對(duì)照品溶液，使其每1 ml分別含果糖5.0001，10.0002，15.0005，20.0073，25.0013 mg，D-無(wú)水葡萄糖5.3337，10.6669，16.0002，21.3341，26.6673 mg。精密吸取系列濃度混合對(duì)照品溶液各15 μl，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X，μg）進(jìn)行線性回歸。果糖回歸方程為：Y=3.07523X+0.18501，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，結(jié)果顯示果糖在75.0015～375.0150 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。葡萄糖回歸方程為：Y=3.2692X+0.1175，相關(guān)系數(shù)r=1.0000，結(jié)果顯示葡萄糖在80.0015～400.0075 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.1項(xiàng)下同一對(duì)照品溶液15 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果果糖、葡萄糖峰面積RSD分別為0.5 %，0.9 %，說(shuō)明本方法精密度較高。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按2.2.2項(xiàng)下方法制備附子理中丸（2號(hào)企業(yè)，批號(hào)為180101）的供試品溶液，進(jìn)樣分析。于2，4，8，12，24 h后分別再次進(jìn)樣分析，記錄并比較果糖、葡萄糖含量的變化，評(píng)價(jià)樣品溶液中果糖、葡萄糖室溫放置不同時(shí)間的穩(wěn)定情況。結(jié)果6個(gè)檢測(cè)點(diǎn)果糖、D-無(wú)水葡萄糖峰面積的RSD分別為0.3 %，0.1 %，表明果糖、葡萄糖在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品附子理中丸（2號(hào)企業(yè)，批號(hào)：180101）6份，按2.2項(xiàng)下方法制備對(duì)照品和供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄并比較果糖、葡萄糖含量的變化。結(jié)果6份樣品的果糖、D-無(wú)水葡萄糖的RSD為分別為0.6 %，0.5 %（均小于2 %），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 取已知含量的附子理中丸（2號(hào)企業(yè)，批號(hào)：180101）樣品約1.5 g，精密稱(chēng)定，置50 ml具塞錐形瓶中，共9份，按樣品含量的50 %，100 %，150 %，分別加入3個(gè)不同濃度果糖、D-無(wú)水葡萄糖的混合對(duì)照品溶液（每個(gè)濃度 3 份），按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率分別為100.03 %，99.34 %，RSD分別為1.33 %，1.42 %，表明該方法回收率良好，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 樣品測(cè)定

精密稱(chēng)取15批次附子理中丸 （大蜜丸）樣品各2份，分別按2.2項(xiàng)方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定果糖和葡萄糖的含量，以外標(biāo)法計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。附子理中丸果糖與葡萄糖總量在23.9 %～50.8 %之間，果糖與葡萄糖比值分別在0.65～2.11之間。

3 討論

蜂蜜是附子理中丸（大蜜丸）的主要輔料，具有潤(rùn)腸降壓、保護(hù)肝臟、增強(qiáng)免疫力的效果[7]，主要成分有蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、維生素、多酚類(lèi)和礦物質(zhì)等。作為一個(gè)復(fù)方藥物，附子理中丸成分復(fù)雜，因此本研究對(duì)提取方式和指標(biāo)成分均進(jìn)行了優(yōu)化選擇。

3.1 指標(biāo)成分的選擇

2015年版《中國(guó)藥典》一部規(guī)定，蜂蜜中果糖和葡萄糖的總含量不得低于60 %，果糖與葡萄糖含量比值不得小于1.0[1]。因此，糖類(lèi)成分為蜂蜜質(zhì)量考察的重要指標(biāo)[8-9]。本研究根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)及樣品測(cè)定結(jié)果，結(jié)合制劑工藝等因素，擬定附子理中丸（大蜜丸）果糖、葡萄糖總量（%）不得少于31.4 %，比值不得小于1.0 %，與藥典標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=9）

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

3.2 柱溫考察

分別設(shè)置柱溫20，25，30，35，40 ℃，測(cè)定供試品溶液，結(jié)果溫度在30 ℃以上色譜峰的保留時(shí)間有嚴(yán)重漂移，考慮到環(huán)境溫度等綜合因素，最終確定試驗(yàn)溫度為25 ℃。

綜上所述，該方法科學(xué)、可靠，能在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測(cè)附子理中丸中果糖和葡萄糖含量，最大限度地排除其他化學(xué)成分的干擾，具有快速、靈敏和準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，為該藥輔料的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。