利用聚多巴胺制備丹參注射液緩釋制劑的研究

朱辰奇　顧依　周琴　劉馨 沈惠明 陳志鵬

摘要 目的：利用聚多巴胺（PDA）對(duì)丹參注射液中多成分進(jìn)行負(fù)載，構(gòu)建丹參注射液（SMI）緩釋制劑（PDA-SMI）。方法：建立丹參注射液的原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B3種成分的分析方法并進(jìn)行含量測(cè)定;制備PDA，在pH值2.5的條件下對(duì)SMI進(jìn)行負(fù)載，制備PDA-SMI;對(duì)PDA-SMI體外釋放行為進(jìn)行考察。結(jié)果：SMI中原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B的濃度分別為0.344、0.214、0.262 mg/mL;PDA-SMI對(duì)原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B的載藥量分別為8.59%，15.90%和20.57%;PDA-SMI中原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B體外累計(jì)釋放率分別為84.05%，77.57%和63.12%。結(jié)論：PDA可以負(fù)載SMI的多種成分，載藥量較高，并具有良好的緩釋效應(yīng)。

關(guān)鍵詞 丹參注射液;聚多巴胺;緩釋制劑;高效液相色譜法

Study on Preparation of Danshen Injection Sustained-release Preparation Using Polydopamine

ZHU Chenqi1，2，GU Yi2，ZHOU Qin1，LIU Xin1，SHEN Huiming1，CHEN Zhipeng2

（1 Department of Pharmacy，Suzhou Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Suzhou 215002，China; 2 School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

Abstract Objective：To use polydopamine（PDA）to carry out multiple components of Salvia miltiorrhiza injection，and to construct a slow-release preparation of Salvia miltiorrhiza injection（SMI）（PDA-SMI）.Methods：Establish the analysis method of the three components of protocatechuic aldehyde，rosmarinic acid and salvianolic acid B of Salvia miltiorrhiza injection and determine the content; prepare PDA，load SMI under the condition of pH 2.5 to prepare PDA-SMI; The in vitro release behavior of PDA-SMI was investigated.Results：The concentrations of protocatechuic aldehyde，rosmarinic acid and salvianolic acid B in SMI were 0.344，0.214 and 0.262 mg/mL，respectively; the loading of protocatechuic aldehyde，rosmarinic acid and salvianolic acid B by PDA-SMI The doses were 8.59%，15.90% and 20.57% respectively; the cumulative release rates of protocatechuic aldehyde，rosmarinic acid and salvianolic acid B in PDA-SMI were 84.05%，77.57% and 63.12%，respectively.Conclusion：PDA can load multiple components of SMI and has a good sustained-release effect.

Keywords Salvia miltiorrhiza injection; Polydopamine; Sustained-release preparation; High performance liquid chromatography

中圖分類號(hào)：R283文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.15.009

隨著人口老齡化程度日益加深，人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，心血管疾病成為了威脅人類健康的頭號(hào)殺手[1]。Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma是唇形科丹參屬植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖[2]。研究表明，丹參中的多種成分對(duì)心血管可以發(fā)揮抗氧化、抗血小板聚集及心肌保護(hù)的作用[3-5]。丹參注射液（Salvia Miltiorrhiza Injection，SMI）是丹參水提醇沉后精制而成，是心肌梗死的住院患者使用頻率最高的中藥制劑，使用頻率高達(dá)35.5%[6]。但是，SMI存在藥物成分在體內(nèi)代謝較快的問題，導(dǎo)致到達(dá)靶部位藥量較少[7-8]。有必要設(shè)計(jì)中藥新型制劑對(duì)SMI進(jìn)行改善，能夠負(fù)載SMI多成分的同時(shí)，具有一定緩釋效應(yīng)。

多巴胺可以在堿性環(huán)境下聚合形成聚多巴胺（Polydopamine，PDA）納米粒[9]。PDA具有良好的生物相容性，可以對(duì)多種藥物同時(shí)進(jìn)行吸附[10-11]。本研究提出利用PDA對(duì)SMI中的多成分進(jìn)行負(fù)載，構(gòu)建中藥新制劑PDA-SMI，賦予其緩釋性能，有助于延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)滯留時(shí)間。見圖1。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 電子天平（德國(guó)Sartorius公司，型號(hào)：BS-124S;高效液相色譜儀（島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司，型號(hào)：LC-2010A HT）;離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：MicroCL）;純水儀（美國(guó)Millipore公司，型號(hào)：Synergy UV）;超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-250DE）;激光粒度分析儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司，型號(hào)：Malvern）;磁力加熱攪拌器，金壇區(qū)西城新瑞儀器廠，型號(hào)：HJ-6;冷凍干燥機(jī)（美國(guó)LABCONCO公司，型號(hào)：Labconco 4.5 L）。

1.2 試劑 鹽酸多巴胺，美國(guó)Sigma-Aldrich公司;對(duì)照品丹酚酸B（批號(hào)：111562-201912，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%）、迷迭香酸（批號(hào)：11871-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%）、原兒茶醛（批號(hào)：114656-201907，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%），中國(guó)食品藥品鑒定研究院;甲醇（批號(hào)：MS1922-801）、乙腈（批號(hào)：19055249）均為色譜純，購(gòu)于美國(guó)天地有限公司;磷酸（批號(hào)：K1819049）為分析純，氨水（濃度25%～28%，批號(hào)：L1719006），購(gòu)于阿拉丁生化科技股份有限公司;純水，南京中醫(yī)藥大學(xué)自制。

1.3 分析樣品 丹參注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1908303）。

2 方法與結(jié)果

2.1 SMI中3種成分含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件 采用Kcromasil 100-S-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～15 min，10%～20%乙腈;15～35 min，20%～25%乙腈;35～45 min，25%～30%乙腈;45～55 min，30%～90%乙腈;檢測(cè)波長(zhǎng)為288 nm;進(jìn)樣量為10 μL;體積流量為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃。

2.1.2 供試品溶液的制備 取SMI 1 mL，加入甲醇9 mL稀釋，13 000 r/min，離心半徑6 cm，離心10 min，取上清過0.45 μm濾膜，即得。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備 取原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，分別置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為276、284、626 μg/mL的對(duì)照品溶液，置于冰箱4 ℃避光保存。

2.1.4 專屬性考察 取“2.1.2”項(xiàng)供試品溶液，取“2.1.3”項(xiàng)對(duì)照品溶液，進(jìn)樣，結(jié)果見圖2。在建立的色譜條件下，相鄰峰之間分離度均大于1.5，方法專屬性良好。

2.1.5 線性關(guān)系考察 取“2.1.3”項(xiàng)對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，過0.45 μm濾膜，進(jìn)樣，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為原兒茶醛Y=39 927 259.03X-23 297.25，r=1.000 0，線性范圍0.276～138.000 μg/mL;迷迭香酸Y=19 065 233.51X+37 000，r=0.999 9，線性范圍0.284～142.000 μg/mL;丹酚酸B Y=10 796 145.52X-21 041.079 59，r=1.000 0，線性范圍0.626～313.000 μg/mL;結(jié)果表明在定量范圍內(nèi)各成分呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6 中間精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以各成分的峰面積值分別計(jì)算，計(jì)算原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 3種成分峰面積的RSD分別為0.15%、0.17%、0.20%，表明選用的儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.1.2”項(xiàng)方法配制供試品溶液，平行6份，進(jìn)樣，計(jì)算原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 3種成分質(zhì)量濃度的RSD分別為1.75%、1.32%、1.46%，表明配制方法重復(fù)性良好。

2.1.8 供試品穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 3種成分峰面積的RSD分別為0.78%、0.40%、0.97%，表明供試品溶液中各成分穩(wěn)定性較好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知3種指標(biāo)成分含量的SMI，精密加入原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B混合對(duì)照品適量，配成質(zhì)量濃度為待測(cè)成分含量的100%的溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度平行6份，計(jì)算各成分的加樣回收率和RSD。計(jì)算原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 3種成分的平均加樣回收率分別為99.82%、98.84%、102.39%，RSD分別為2.24%、2.15%、1.54%，表明本方法回收率良好。

2.1.10 樣品測(cè)定 用外標(biāo)法計(jì)算出SMI中的原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B的濃度分別為0.344、0.214、0.262 mg/mL。

2.2 PDA-SMI的合成和表征

2.2.1 PDA的合成 精密稱取200 mg鹽酸多巴胺溶于40 mL純水中，攪拌至完全溶解，加入16 mL無(wú)水乙醇和1 mL氨水，磁力攪拌24 h，13 000 r/min，離心半徑 6 cm，高速離心15 min，棄上清，沉淀用純水洗3次，得到PDA納米粒溶液，凍干后進(jìn)行定量。

2.2.2 PDA-SMI制備及載藥量測(cè)定 取2 mL SMI加入7 mL純水中，混勻，用稀鹽酸（1 M）調(diào)節(jié)pH至2.5，加入1 mL的含有2 mg PDA的純水（pH值2.5），避光，磁力攪拌8 h，13 000 r/min，離心半徑6 cm，高速離心15 min，取上清。通過“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定載藥前后溶液中藥量，如圖2，并按公式分別計(jì)算各成分的載藥量，載藥量=（藥物的原始質(zhì)量-上清中殘留藥物的質(zhì)量）/[PDA的質(zhì)量+（藥物的原始質(zhì)量-上清中殘留藥物的質(zhì)量）]，液相結(jié)果見圖3。通過公式計(jì)算，原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B的載藥量分別為6.59%，17.60%和20.75%，載藥量較高。

2.2.3 粒徑分布 用粒徑測(cè)定儀PDA-SMI納米粒粒徑變化。見圖4。載藥后平均粒徑為（305.1±6.8）nm，粒徑分布較窄。

2.2.4 形態(tài)觀察 取適量PDA-SMI溶于純水中，滴至銅網(wǎng)，烘干，通過透射電鏡TEM觀察形態(tài)。PDA-SMI為球形納米結(jié)構(gòu)。見圖5。

2.3 PDA-SMI體外釋放實(shí)驗(yàn) 取PDA-SMI溶液放置于相對(duì)分子質(zhì)量為800～1 000的透析袋中，釋放環(huán)境為pH值7.4的PBS緩沖液，溫度為37 ℃，按預(yù)定時(shí)間取釋放溶液，補(bǔ)加同溫同體積的PBS緩沖液，每個(gè)樣品平行3份，計(jì)算累積釋放量并繪制時(shí)間累積釋放率曲線，結(jié)果見圖6。在48 h內(nèi)，原兒茶醛釋放84.05%，迷迭香酸釋放77.57%，丹酚酸B釋放63.12%，具有明顯的緩釋效應(yīng)。

3 討論

3.1 載藥指標(biāo)成分的選擇 原兒茶醛，迷迭香酸和丹酚酸B這3個(gè)成分是SMI中含量較高的成分之一，也是SMI治療心血管疾病的主要藥效成分。Wan等[12]研究發(fā)現(xiàn)，原兒茶醛可以通過抑制異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的心肌組織纖維化和膠原沉積。Javidanpour等[13]研究表明，迷迭香酸可以抑制脂質(zhì)過氧化和NCX1的過表達(dá)，提前給藥可以預(yù)防心肌梗死后心肌肥厚、心律失常和心功能障礙的發(fā)生率。Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸可以通過抑制AMPKα/Smad3信號(hào)通路，抑制心臟纖維化的產(chǎn)生。丹酚酸B促血管新生和抗ROS被廣泛報(bào)道，有助于改善梗死部位的局部缺血和心肌細(xì)胞微環(huán)境[15-17]。PDA對(duì)丹參素載藥量較低，故未將丹參素列為指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析。

3.2 載藥工藝的選擇 前期研究中，驗(yàn)證了SMI在酸性環(huán)境的穩(wěn)定性，確保了載藥過程中藥物自身的穩(wěn)定性，并且利用PDA對(duì)丹參水提液中的成分進(jìn)行了負(fù)載預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境下對(duì)多種水溶性成分存在明顯的吸附效應(yīng)。本研究選用SMI，分別對(duì)不同pH值（2.0，2.5，3.0，3.5和4.0）和不同載藥時(shí)間（2、4、8 h）進(jìn)行考察，比較不同pH值下的載藥量，發(fā)現(xiàn)在pH值2.5時(shí)載藥量最高，載藥時(shí)間為8 h。載藥前后電位數(shù)據(jù)表明載藥機(jī)制為靜電吸附，利用PDA在pH值小于4的環(huán)境下的正電荷，對(duì)SMI多成分進(jìn)行吸附。PDA靜電吸附的載藥機(jī)制有助于保持藥物分子的完整性，在中性環(huán)境下，pH值發(fā)生電荷翻轉(zhuǎn)，引起吸附藥物的緩釋[18-19]。

3.3 小結(jié) 中藥是多組分、多靶點(diǎn)及其組分間協(xié)同作用的復(fù)雜體系，大劑量負(fù)載中藥多成分是開發(fā)中藥新制劑的關(guān)鍵難點(diǎn)。本研究利用PDA對(duì)SMI中的主要藥效成分成分進(jìn)行一個(gè)高效率的負(fù)載，載藥量較高，載藥機(jī)制明確，可控性強(qiáng)，且具有明顯的緩釋效應(yīng)，可以作為開發(fā)中藥多成分復(fù)雜體系制劑的新策略。

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（2020-07-01收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFC1706905）——中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究;蘇州市科技發(fā)展計(jì)劃基金項(xiàng)目（SYSD2019187，SYSD2018242）作者簡(jiǎn)介：朱辰奇（1991.02—），男，碩士，藥師，研究方向：中藥新型制劑研究，Tel：（0512）62362103，E-mail：zhu65134@163.com通信作者：陳志鵬（1978.10—），男，博士，教授，研究方向：中藥新型制劑研究，Tel：（025）85811071，E-mail：czpcpu@hotmail.com