非洲豬瘟病毒檢測(cè)方法研究進(jìn)展

胡 焱，徐春志，方 英，張 海，孫 成，景書(shū)灝，藺俐仲，楊 峰，黎盛琴

(1. 貴陽(yáng)市烏當(dāng)區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州貴陽(yáng)550018； 2. 貴陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽(yáng)550081；3. 中國(guó)致公黨貴陽(yáng)市委員會(huì)，貴州貴陽(yáng)550081； 4. 貴陽(yáng)市草地站，貴州貴陽(yáng)550081)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起豬的1種烈性傳染病，臨床上以急性、熱性、出血性、高發(fā)病率和高死亡率為特征。ASFV是非洲豬瘟病毒科，非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，是目前已知的唯一的1個(gè) DNA蟲(chóng)媒病毒[1]。ASFV于1921年在非洲肯尼亞首次被報(bào)道[2]。1957年傳入歐洲國(guó)家葡萄牙，此后的70～80年代相繼在歐洲和美洲多個(gè)國(guó)家暴發(fā)。2007年傳入高加索地區(qū)格魯吉亞，8月、11月分別在亞美尼亞、俄羅斯發(fā)現(xiàn)ASF疫情[3]。2012—2014年烏克蘭、白俄羅斯、波蘭、拉脫維亞和愛(ài)沙尼亞相繼報(bào)道ASF疫情；2017年意大利、捷克和羅馬尼亞暴發(fā)該病[4]。2018年8月我國(guó)遼寧省沈陽(yáng)市首次報(bào)道ASF 疫情，此后河南、江蘇、浙江、安徽、黑龍江、內(nèi)蒙古、吉林、天津、山西、云南、湖南和貴州等地相繼暴發(fā)該病，給養(yǎng)豬業(yè)和國(guó)民經(jīng)濟(jì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)ASFV的p72基因鑒定，2018年8月在我國(guó)沈陽(yáng)分離到的第1例ASFV屬于p72基因Ⅱ型，與俄羅斯及東歐目前流行的格魯吉亞毒株基因型一致，屬于同一進(jìn)化分支[5]。由于目前仍缺乏安全、有效預(yù)防的疫苗，我國(guó)采取隔離、撲殺、無(wú)害化處理、消毒等措施使疫情得到有效控制。ASFV的檢測(cè)對(duì)于疫情的及時(shí)處置及防控十分重要。本文就ASFV的結(jié)構(gòu)特征及檢測(cè)方法進(jìn)行闡述，供參考。

1 ASFV結(jié)構(gòu)特征

ASFV基因組為線性雙鏈DNA分子，長(zhǎng)度為170～193 kb，不同的毒株因基因組可變區(qū)長(zhǎng)度不同，基因組大小存在差異。目前已知其基因組有151～167個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼170多種蛋白質(zhì)，成熟的病毒粒子包含54種結(jié)構(gòu)蛋白[6]。ASFV顆粒是由幾個(gè)同心區(qū)域組成的二十面體形態(tài)，中心基因組形成的內(nèi)核包含核仁[7]。細(xì)胞外病毒顆粒具有外部包膜[8]。這種包膜的重要性尚不清楚，目前的研究發(fā)現(xiàn)病毒感染不需要這種包膜的參與[9]。根據(jù)編碼衣殼蛋白p72的B646L基因序列的不同，AFSV至少可以分為24個(gè)基因型，根據(jù)病毒粒子不同的抗原性可將ASFV分為8個(gè)血清型[6，9]。ASFV可以通過(guò)豬之間直接接觸傳播(如口鼻或皮膚傷口等)。感染豬的血液中有高含量的病毒，也存在于排泄物和分泌物中(如尿液、唾液、糞便等)。有的研究表明，ASFV可通過(guò)氣溶膠在短距離內(nèi)傳播[10]。該病毒可在肉制品中存活數(shù)周或數(shù)月，飼喂帶毒的餐廚剩余物是導(dǎo)致家豬感染的重要途徑[11]。研究表明ASFV抗體對(duì)同源毒株具有保護(hù)作用[12，13]。

2 ASFV檢測(cè)技術(shù)

在ASFV尚未傳入我國(guó)時(shí)，國(guó)內(nèi)學(xué)者已對(duì)ASFV開(kāi)展了相關(guān)研究，常華等[14]在2006年對(duì)ASFV的VP73基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)，2007年張泉等[15]建立了ASFV常規(guī)PCR檢測(cè)方法，李維彬等[16]建立了ASFV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，為我國(guó)ASFV檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。目前普通PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR是實(shí)驗(yàn)室常用的檢測(cè)方法。許多新型的檢測(cè)技術(shù)，如LAMP技術(shù)、交叉引物擴(kuò)增法等也應(yīng)用于ASFV的檢測(cè)。

2.1 病原分子生物學(xué)檢測(cè)

2.1.1 普通PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是在模板DNA、引物、4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，將待擴(kuò)增的DNA片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“變性—退火—延伸”3步反應(yīng)的多次循環(huán)，使DNA片段呈指數(shù)擴(kuò)增[17，18]。該技術(shù)是1985年美國(guó)學(xué)者M(jìn)ullis等發(fā)明，并于1993年獲得諾貝爾獎(jiǎng)，主要應(yīng)用于分子克隆、基因表達(dá)、檢測(cè)等。普通PCR可對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定性和半定量分析。鑒定ASFV的PCR引物一般都是根據(jù)靶向病毒基因組高度保守區(qū)域p72基因設(shè)計(jì)，具有較高特異性和敏感性，適合各類ASFV毒株的檢測(cè)[19]。

2.1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上添加熒光染料或熒光探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知濃度模板進(jìn)行定量分析的方法。與普通PCR技術(shù)相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)就是可以實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR反應(yīng)中的初始模板進(jìn)行定量，克服了PCR的平臺(tái)效應(yīng)，使定量更靈敏、更精準(zhǔn)、更特異(可進(jìn)行單個(gè)核苷酸的區(qū)分)，普通PCR可對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定性和半定量分析，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，更靈敏，是目前ASFV檢測(cè)使用最多的方法[20，21]。

2.1.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)被應(yīng)用于病毒核酸的檢測(cè)。此項(xiàng)技術(shù)是日本學(xué)者Notomi研究開(kāi)發(fā)的1種恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異性引物，利用具有鏈轉(zhuǎn)換特性的Bst DNA聚合酶在等溫條件下恒溫幾十分鐘，使得鏈轉(zhuǎn)換DNA合成在不停地自我循環(huán)，完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，用肉眼就可判斷結(jié)果[22]。2008年王彩霞[23]建立了用于ASFV的 LAMP快速檢測(cè)方法；James H E等[24]也將LAMP技術(shù)應(yīng)用于ASFV的檢測(cè)。該檢測(cè)方法針對(duì)ASFV的拓?fù)洚悩?gòu)酶基因Ⅱ，其特異性已通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)的產(chǎn)物得以證實(shí)，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)之間具有良好的一致性，具有簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。

2.1.4 交叉引物擴(kuò)增法交叉引物擴(kuò)增(Crossing Priming Amplification，CPA)是使用Bst DNA聚合酶及多個(gè)引物和探針的新型等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)技術(shù)，是1種快速、靈敏且特異性高的等溫?cái)U(kuò)增方法[25]。 CPA通常需要1套3～8個(gè)互補(bǔ)引物，這些引物可識(shí)別已鑒定的DNA中的特定基因座，并使用具有等溫作用的聚合酶(如Bst、Bsm或GspSSD)，表現(xiàn)出很強(qiáng)的鏈置換作用。添加可結(jié)合雙鏈反應(yīng)產(chǎn)物的熒光染料(如SYBR Green Ⅰ)，在紫外光下可觀察到結(jié)合形成的熒光雙鏈DNA產(chǎn)物，陽(yáng)性樣品呈綠色熒光，陰性樣品不顯示任何熒光。該方法的特點(diǎn)是靈敏度高，無(wú)需提取病毒DNA。

2.2 病毒分離法(紅細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn))病毒分離法是ASFV重要的病原學(xué)診斷技術(shù)，但該方法對(duì)生物安全等級(jí)、技術(shù)條件等方面要求苛刻，只能在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部指定的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。ASFV可以感染豬的多種白細(xì)胞，并在其中復(fù)制，感染后的白細(xì)胞能夠吸附豬紅細(xì)胞，吸附后48～72 h裂解，目前還未發(fā)現(xiàn)豬的其他病毒具有這種特性[27]。因此，紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)仍然是較敏感的ASFV檢測(cè)技術(shù)。該方法的缺點(diǎn)是相對(duì)耗時(shí)費(fèi)力。

2.3 血清學(xué)檢測(cè)

2.3.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是將抗原或抗體吸附在固相載體表面，檢測(cè)相應(yīng)抗體或抗原的方法。該法檢測(cè)ASFV抗體方法包括間接ELISA和阻斷ELISA 2種，所用的包被抗原不盡相同[28]。為提高敏感性，Cubillos C等[29]利用p30重組蛋白(p30r)建立ELISA檢測(cè)方法，用于多個(gè)地區(qū)的ASFV血清學(xué)診斷，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)ASFV抗體；仇華磊[30]以原核表達(dá)重組VP72作為抗原建立ELISA檢測(cè)方法具有很高的敏感性。ELISA檢測(cè)方法敏感性高，但若樣品保存不好、出現(xiàn)腐敗變質(zhì)等情況會(huì)導(dǎo)致敏感性降低。

2.3.2 雙抗體夾心ELISA法雙抗體夾心ELISA是將特異性單克隆抗體包被聚苯乙烯微量反應(yīng)96孔板，作為捕獲抗體加入酶標(biāo)液的待檢樣品如果含有ASFV抗原，則能與單克隆抗體特異性結(jié)合形成酶標(biāo)復(fù)合體，洗滌凈化復(fù)合物，加入底物，發(fā)生酶催顯色反應(yīng)，有色產(chǎn)物量與ASFV量相關(guān)聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)ASFV的定性或半定量檢測(cè)。該方法具有快速、高通量、費(fèi)用低等特點(diǎn)，但檢測(cè)敏感性相對(duì)較低。

2.3.3 直接免疫熒光試驗(yàn)用熒光素標(biāo)記抗ASFV特異性多抗或者單克隆抗體，然后將熒光素標(biāo)記抗體與組織壓片、觸片以及冷凍切片上的抗原直接進(jìn)行反應(yīng)。直接免疫熒光抗原檢測(cè)特異性、敏感性較高，但該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室的生物安全防護(hù)條件、操作技術(shù)及儀器設(shè)備要求較高，應(yīng)用受到一定限制[31]。

2.3.4 間接免疫熒光試驗(yàn)將感染ASFV的原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞固定于細(xì)胞板或載玻片上，加入待檢血清樣品，如果被檢血清中含ASFV特異性抗體，就會(huì)與細(xì)胞中的ASFV抗原結(jié)合，并與熒光素標(biāo)記的二抗特異結(jié)合形成熒光復(fù)合物，顯微鏡下觀察該復(fù)合物可做出定性或半定量判斷[31]。間接免疫熒光試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)條件及操作要求較高。

2.3.5 免疫印跡試驗(yàn)免疫印跡是1種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)和識(shí)別蛋白質(zhì)的方法。Kazakova A S等[32]制備高純度的重組蛋白p30(ASFV內(nèi)膜的一部分，是1種早期蛋白)，應(yīng)用于ASFV免疫印跡診斷方法，可在感染后6～8天從家豬或野豬血清樣品中檢測(cè)ASFV特異性抗體。該法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備、操作技術(shù)有較高的要求。

2.3.6 膠體金免疫層析法膠體金免疫層析是將膠體金標(biāo)記、免疫層析及新材料免疫等技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)特異的抗原抗體反應(yīng)對(duì)抗原進(jìn)行檢測(cè)。膠體金免疫層析技術(shù)具有特異性高、操作簡(jiǎn)單、快速等特點(diǎn)，適合基層快速初診[33，34]。如：北京森康生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)的“非洲豬瘟病毒抗原檢測(cè)試紙條”用于臨床快速檢測(cè)，但僅限于疑似病豬、死豬ASFV的快速檢測(cè)，確診仍需實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步檢測(cè)。膠體金免疫層析方法除了可以應(yīng)用于抗原檢測(cè)，也適用于抗體的檢測(cè)。2014年張?chǎng)斡畹萚35]建立了ASFV p54抗體的膠體金檢測(cè)方法，該法特異性高，與豬的其他病毒抗體陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。林彥星等[36]研發(fā)的量子點(diǎn)免疫層析試紙條可快速檢測(cè)ASFV抗體。膠體金免疫層析法檢測(cè)假陽(yáng)性率高，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的應(yīng)采用實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)一步確診，對(duì)于檢測(cè)樣品抗原或抗體濃度有一定要求，在病毒感染早期檢出率低。

3 小結(jié)與展望

3.1對(duì)于ASFV的每種檢測(cè)方法都有優(yōu)缺點(diǎn)。目前最常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法為實(shí)時(shí)熒光定量PCR和普通PCR，這是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的檢測(cè)方法。病毒分離方法具有很高的特異性和敏感性，但是耗時(shí)較長(zhǎng)，且有些ASFV毒株不具備吸附紅細(xì)胞的能力，如果采用細(xì)胞吸附試驗(yàn)方法只能觀察到細(xì)胞病變但未見(jiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，應(yīng)結(jié)合PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷。PCR檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高，但需專用設(shè)備和試劑。膠體金免疫技術(shù)快速檢測(cè)不需要實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，特異性高，攜帶方便，肉眼可直接觀察結(jié)果，但其敏感性較低，應(yīng)用范圍較窄，在感染早期有可能出現(xiàn)假陰性，只適用于疑似病豬或不明原因死亡豬的初步檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果仍然需要PCR檢測(cè)結(jié)果作最終判斷。LAMP有比較高的特異性和抗干擾能力，非目的片段對(duì)LAMP反應(yīng)的干擾較小，反應(yīng)過(guò)程簡(jiǎn)單、快速、高效，但操作過(guò)程中試管開(kāi)蓋容易形成氣溶膠污染，對(duì)于條件較差的屠宰場(chǎng)檢測(cè)室可能造成假陽(yáng)性問(wèn)題。由于目前還沒(méi)有ASF疫苗接種，血清學(xué)抗體檢測(cè)陽(yáng)性即可判定為野毒感染，并且可用于慢性、隱性感染動(dòng)物的大規(guī)模篩查，有助于該病的防控和凈化。

3.2隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多新型的病毒檢測(cè)技術(shù)不斷被研發(fā)，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)尤為突出，如LAMP、CPA、PCLSR均是核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。在保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢測(cè)方法靈敏度的前提下，病毒的檢測(cè)技術(shù)正向著簡(jiǎn)便、快速、低成本的方向發(fā)展。另外，生物傳感器的研究也可用于ASFV的檢測(cè)，Biagetti M設(shè)計(jì)了1種基于ASFVvp72編碼基因區(qū)域的ssDNA/LNA探針，是1種無(wú)標(biāo)記可重復(fù)使用的核酸生物傳感器，可用于篩查豬的血液樣本是否存在ASFV感染[37]。

3.3從ASF疫情流行的國(guó)家和地區(qū)防控工作來(lái)看，ASF的防控工作是一場(chǎng)持久戰(zhàn)。一方面應(yīng)加速疫苗的研制；另一方面要從提高生物安全水平措施方面著手。我國(guó)生豬屠宰企業(yè)的經(jīng)營(yíng)模式使得屠宰場(chǎng)成為病原聚集和擴(kuò)散的高危區(qū)，存在很大的安全隱患。屠宰企業(yè)開(kāi)展病毒的自檢工作是很有必要的，也是未來(lái)的1種長(zhǎng)久趨勢(shì)和要求。為落實(shí)企業(yè)主體責(zé)任，很多地區(qū)生豬屠宰場(chǎng)已按要求開(kāi)展ASFV自檢工作。