在醫(yī)療船上開(kāi)展精準(zhǔn)病理診斷技術(shù)

【摘 要】：目的 在醫(yī)療船上開(kāi)展快速石蠟切片和免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，為快速和精準(zhǔn)病理診斷打下基礎(chǔ)。方法 開(kāi)展病理組織快速制片過(guò)程，病理組織經(jīng)過(guò)95%、100%梯度酒精脫水和二甲苯透明、浸蠟和石蠟切片過(guò)程，以及開(kāi)展手工免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，包括抗原修復(fù)、抗原和抗體孵育、顯色等步驟實(shí)現(xiàn)快速和精準(zhǔn)病理診斷。結(jié)果 經(jīng)過(guò)快速石蠟流程的病理切片在鏡下組織結(jié)構(gòu)清晰，手工免疫組化結(jié)果陽(yáng)性定位清晰、不擴(kuò)散，陰性結(jié)果不著色、背景清晰、無(wú)非特異性著色。整個(gè)手工免疫組化過(guò)程由人工控制，在處理抗原修復(fù)和抗體孵育時(shí)間、陽(yáng)性著色過(guò)深、過(guò)淡和非特異著色方面可進(jìn)行人工干預(yù)，免疫組化結(jié)果更利于病理醫(yī)生判讀。在醫(yī)療船上實(shí)現(xiàn)快速和精準(zhǔn)病理診斷只需配備簡(jiǎn)易的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和培訓(xùn)病理醫(yī)生即可實(shí)現(xiàn)。結(jié)論 為了在醫(yī)療船上實(shí)現(xiàn)快速和精準(zhǔn)病理診斷，可以嘗試在醫(yī)療船上開(kāi)展病理快速石蠟切片和免疫組化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)病理快速和精準(zhǔn)診斷，要加速配備醫(yī)療船上的病理實(shí)驗(yàn)設(shè)施和培養(yǎng)病理醫(yī)生的綜合素質(zhì)，更好的服務(wù)我們海軍官兵和更多群體。

【關(guān)鍵詞】：快速病理制片;免疫組織化學(xué);精準(zhǔn)病理診斷;醫(yī)療船

Abstract：Objective Rapid paraffin sections and immunohistochemical staining were carried out on medical ships to lay the foundation for rapid and accurate pathological diagnosis. Methods rapid histopathological production was carried out. pathological tissues were subjected to 95%，100% gradient alcohol dehydration and xylene transparent， wax and paraffin sections， and manual immunohistochemical staining techniques， including antigen repair， antigen and antibody incubation， color development and other steps to achieve rapid and accurate pathological diagnosis. Results The pathological sections of the rapid paraffin process were clearly organized under the microscope， the positive localization was clear and non-diffusion was observed. The whole process of manual immunohistochemistry was controlled by artificial intervention in the treatment of antigen repair and antibody incubation time， too deep positive coloring， too light and non-specific coloring. The results of immunohistochemistry were more favorable for pathologists to interpret. Rapid and accurate pathological diagnosis on a medical ship can be achieved only with simple experimental equipment and training of pathologists. Conclusion In order to achieve rapid and accurate pathological diagnosis on medical ship， we can try to carry out pathological rapid paraffin section and immunohistochemistry technology on medical ship to realize pathological rapid and accurate diagnosis. It is necessary to speed up the installation of pathological experimental facilities on medical ship and cultivate the comprehensive quality of pathologists， and better serve our navy officers and soldiers and more groups.

keywords： Rapid Pathology; immunohistochemistry;;Accurate Pathological Diagnosis;medical boat

【中圖分類(lèi)號(hào)】R733.1【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1672-3783（2020）08-24--02

引言：

隨著我國(guó)海軍建設(shè)的不斷發(fā)展，作為服務(wù)和保障我國(guó)海軍力量的海軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)務(wù)人員的素質(zhì)培養(yǎng)就顯得尤為重要。為了保障海軍的每次出海和遠(yuǎn)洋任務(wù)，確保醫(yī)療船上設(shè)施的齊全和醫(yī)務(wù)人員的素質(zhì)至關(guān)重要。分析近端時(shí)期出海保障任務(wù)的實(shí)際情況，覺(jué)得有必要進(jìn)一步加強(qiáng)醫(yī)療船上的醫(yī)療設(shè)施配備和醫(yī)務(wù)人員素質(zhì)的進(jìn)一步提高。

現(xiàn)有醫(yī)療船上的醫(yī)療保障體系總體是較為完備的，日常的官兵醫(yī)療檢查包括：聽(tīng)診、測(cè)血壓、抽血檢驗(yàn)、X光攝片、B超、心電圖檢查、注射輸液等一整套服務(wù)保障較為全面。即便官兵罹患腫瘤等疾病也可以開(kāi)展手術(shù)及病理冰凍切片，由病理醫(yī)生為其作出診斷。由于冰凍切片只能提供初步診斷，有時(shí)會(huì)耽誤病情，要想得到精準(zhǔn)的病理診斷需要進(jìn)行石蠟HE切片。開(kāi)展石蠟HE切片需要大型的病理組織脫水機(jī)和病理組織包埋機(jī)才能實(shí)現(xiàn)，現(xiàn)在介紹一種病理組織快速制片過(guò)程，病理組織經(jīng)過(guò)95%、100%梯度酒精脫水和二甲苯透明、浸蠟和石蠟切片過(guò)程即可完成。同時(shí)進(jìn)一步開(kāi)展手工免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，包括抗原修復(fù)、抗原和抗體孵育、顯色等步驟即可實(shí)現(xiàn)快速和精準(zhǔn)病理診斷。

1 材料和方法：

開(kāi)展組織快速脫水流程，需要的設(shè)備包括95%酒精1瓶500ml、100%酒精1瓶500ml、二甲苯1瓶500ml、病理專(zhuān)用石蠟數(shù)塊、恒溫箱一臺(tái)、四個(gè)不銹鋼小罐子、石蠟切片機(jī)、攤片機(jī)、病理載玻片、蘇木素和伊紅染液，在30分鐘內(nèi)即可制成病理組織蠟塊，然后通過(guò)石蠟切片制作成HE病理切片。同時(shí)開(kāi)展手工免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，材料包括：家用電磁爐一臺(tái)、家用不銹鋼鍋?zhàn)右粋€(gè)（3000ml）、孵育盒、免疫組化試劑、免疫組化防脫片、蒸餾水等即可。通過(guò)抗原修復(fù)、抗原和抗體孵育、顯色即可完成免疫組化染色操作步驟，實(shí)現(xiàn)HE病理切片和免疫組化染色技術(shù)在醫(yī)療船上的應(yīng)用。

1.1 病理組織蠟塊制作方法：把手術(shù)或者穿刺小標(biāo)本用小塊紗布包裹放入恒溫箱內(nèi)浸入95%的酒精5分鐘后，再進(jìn)入100%酒精5分鐘，然后進(jìn)入二甲苯5分鐘后用石蠟包埋即完成病理組織塊的制作。然后由病理醫(yī)生通過(guò)石蠟切片在1-2分鐘內(nèi)制作成完成，通過(guò)烤片、手工染色，一般在20分鐘之內(nèi)即可完成一張HE病理切片，非常節(jié)約時(shí)間、成本極低。

對(duì)于疑難的病理診斷還可以開(kāi)展手工免疫組織化學(xué)檢查項(xiàng)目，免疫組織化學(xué)檢查一般都在后方醫(yī)院進(jìn)行，需要全自動(dòng)免疫組化儀才能開(kāi)展，一般時(shí)間較長(zhǎng)，需要一至兩天的工作流程。而手工免疫組織化學(xué)檢查方法只需要2-3小時(shí)，運(yùn)用經(jīng)典的手工抗原修復(fù)方法、抗原抗體結(jié)合、顯色即可完成。

1.2 免疫組化技術(shù)具體方法：

1.2.1 修復(fù)抗原

把插入染色架的切片放入二甲苯中進(jìn)行脫蠟約20分鐘，切片依次經(jīng)過(guò)二甲苯、梯度酒精至水洗。取40mlEDTA原液（PH8.0）倒入不銹鋼鍋中再倒入2000ml蒸餾水，將修復(fù)液徹底浸沒(méi)所有切片，加熱至沸騰然后計(jì)時(shí)20分鐘，保持小火力沸騰，然后關(guān)閉電磁爐，室溫下自然冷卻至室溫后流水沖洗，PBS洗3次，每次2分鐘。

1.2.2 過(guò)氧化氫封閉阻斷

把沖洗好的切片放置于濕盒中，在所有的切片上滴加0.3%過(guò)氧化氫放置2分鐘，用于阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，減少背景著色。

1.2.3 滴加一抗

把切片平鋪在濕盒中，然后加載（一抗）100ul，室溫下放置1小時(shí)整，然后把所有切片用PBS緩沖液洗3次，每次2分鐘。

1.2.4 滴加二抗

把所有的切片平鋪在濕盒中，加載二抗（羊抗鼠/兔IgG聚合物），室溫下孵育20分鐘然后PBS洗3次，每次2分鐘。

1.2.5 顯色、蘇木素襯染細(xì)胞核

選用DAB顯色試劑盒配制顯色液，用等量的緩沖液、底物、色原然后進(jìn)行20倍稀釋配成顯色劑待用。在所有的切片上各滴加100ul的DAB顯色液顯色5分鐘，根據(jù)顯色程度最長(zhǎng)10分鐘，然后用水沖洗終止顯色。把所有顯色好的切片分成幾架放置于蘇木素染液中襯染細(xì)胞核1-2分鐘后水洗，用0.5-1%鹽酸酒精分化后再浸入流水沖洗，然后置于37攝氏度溫水中藍(lán)化。

1.2.6 切片脫水、透明

把所有的切片經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水、二甲苯透明再用樹(shù)膠進(jìn)行封片。

1.2.7 鏡下分析觀察染色結(jié)果

這種手工方法與全自動(dòng)免疫組化儀器比起來(lái)，效果絕不遜色而且結(jié)果和滿(mǎn)意度可能超越全自動(dòng)機(jī)器。因?yàn)槿斯し椒ǜ深A(yù)性強(qiáng)，在抗原修復(fù)和抗原抗體結(jié)合的時(shí)間上可以靈活機(jī)動(dòng)、改變時(shí)差。我科在全國(guó)和上海市歷年病理石蠟切片、冰凍切片和免疫組織化學(xué)技術(shù)競(jìng)賽中運(yùn)用手工方法多次超越全自動(dòng)機(jī)器獲獎(jiǎng)。

2 結(jié)果：

經(jīng)過(guò)快速石蠟流程的病理切片在鏡下顯示組織結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞核輪廓及核染色質(zhì)清晰，細(xì)胞質(zhì)著色鮮艷，核質(zhì)對(duì)比好，相比較冰凍切片，細(xì)胞核和染色質(zhì)不清晰，細(xì)胞質(zhì)著色不鮮艷，鏡下組織結(jié)構(gòu)模糊等方面染色效果有極大的提高。有了這樣高品質(zhì)的快速石蠟病理切片，病理醫(yī)生即使遇上不典型的病例也能迅速做出快速精準(zhǔn)的診斷。遇上疑難的病例，手工免疫組化結(jié)果可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)迅速提示患者腫瘤的良惡性及原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移等信息、惡性腫瘤來(lái)源以及鑒別診斷。手工免疫組化結(jié)果在鏡下顯示：組化陽(yáng)性為棕色，背景清晰，細(xì)胞核、細(xì)胞漿、細(xì)胞膜陽(yáng)性定位清晰不擴(kuò)散、陽(yáng)性著色適中，著色既不淡也不過(guò)于深。組化陰性結(jié)果為不著色，背景無(wú)非特異性著色。整個(gè)手工免疫組化過(guò)程由人工控制，在處理抗原修復(fù)和抗體孵育時(shí)間長(zhǎng)短、陽(yáng)性定位著色過(guò)深、過(guò)淡和非特異著色方面可以進(jìn)行人工干預(yù)，使得組化結(jié)果更利于病理醫(yī)生判讀。

3 結(jié)論：

為了在醫(yī)療船上實(shí)現(xiàn)快速和精準(zhǔn)病理診斷，可以在船上開(kāi)展病理快速石蠟切片和免疫組化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)病理快速和精準(zhǔn)診斷。由于病理醫(yī)生在冰凍切片技術(shù)的支持下只能做出初步的病理診斷結(jié)果，在遇到不典型和疑難的病例中則無(wú)法做出精準(zhǔn)的病理診斷，開(kāi)展病理快速石蠟切片和免疫組化技術(shù)可以彌補(bǔ)冰凍切片技術(shù)的不足，可以讓病理醫(yī)生遇到不典型和疑難病例的時(shí)候做出快速和精準(zhǔn)的病理診斷。

由于各單位病理醫(yī)生常年忙于醫(yī)院繁重的常規(guī)醫(yī)療任務(wù)，對(duì)于病理技術(shù)方面尤其是快速石蠟切片技術(shù)和免疫組織化學(xué)手工技術(shù)可能經(jīng)驗(yàn)不足。因?yàn)樵诤蠓结t(yī)院常規(guī)工作中，病理石蠟、冰凍切片、免疫組織化學(xué)技術(shù)是醫(yī)技人員的工作職責(zé)，醫(yī)生一般無(wú)需過(guò)于深入掌握，這就需要我們根據(jù)當(dāng)前形勢(shì)把快速石蠟切片和免疫組化手工技術(shù)運(yùn)用到醫(yī)療船上，加速配備醫(yī)療船上的病理實(shí)驗(yàn)設(shè)施和培養(yǎng)病理醫(yī)生的綜合素質(zhì)，讓海軍官兵和更多群體在執(zhí)行長(zhǎng)時(shí)間遠(yuǎn)洋任務(wù)的時(shí)候能隨時(shí)知道自己的精準(zhǔn)病情。這就需要我們通過(guò)學(xué)習(xí)和培訓(xùn)來(lái)掌握更多的病理技術(shù)知識(shí)，更好的服務(wù)我們海軍官兵和更多群體，其意義非常深遠(yuǎn)。

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