3株犬源乳酸桿菌的分離鑒定與益生特性研究

田其真，唐晨晨，沈丹晴，黃銀云，蔡丙嚴(yán)

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

乳酸桿菌是人和動物胃腸道中的優(yōu)勢菌群，其在調(diào)節(jié)機體腸道微生態(tài)平衡、促生長、增強免疫力和抗感染等多方面發(fā)揮重要作用[1-2]，也是廣泛應(yīng)用于制備保健或疾病防治用益生菌制劑的主要菌株[3]。目前，益生菌制劑作為生物獸藥和飼料添加劑，在豬、雞、牛、羊等動物腸炎、腹瀉病的治療和預(yù)防上已發(fā)揮了日益顯著的作用[4-5]。伴隨寵物產(chǎn)業(yè)的興起，國內(nèi)外寵物保健品市場有著廣闊的前景，針對幼齡寵物犬胃腸道健康具有保健作用的益生菌制劑需求大幅增長。但市場上進口的犬用益生菌制劑價格昂貴且質(zhì)量良莠不齊，國產(chǎn)寵物犬益生菌制劑研究應(yīng)用相對較少。菌種選擇是益生菌制劑技術(shù)成敗的關(guān)鍵因素之一，因此對菌種益生特性的研究和篩選已成為焦點。KUMAR等[6]證實，將犬源約氏乳桿菌CPN23給試驗犬連續(xù)口服63 d，可以增加糞便中乙酸和丁酸的含量，減少糞便氨氣的排放，促進腸道健康。BAILLON等[7]研究發(fā)現(xiàn)，給健康犬飼喂嗜酸乳桿菌DSM13241，既能改善犬的腸道菌群組成，也能提高相關(guān)免疫功能。全志海[8]將犬源棒狀乳酸桿菌和瑞士乳酸桿菌飼喂犬，供試犬平均日增質(zhì)量提高14.76%，腹瀉率下降6.22%。任普軍[9]從犬的糞便中分離出嗜酸乳酸桿菌、干酪乳酸桿菌和腸球菌，并將其按一定比例制成益生菌制劑飼喂腹瀉犬，結(jié)果表明，對致病性大腸桿菌所致的腹瀉模型犬具有較好的治療效果。李艷欣[10]將分離自犬腸道的動物乳酸桿菌飼喂犬，14 d后發(fā)現(xiàn)試驗犬腸道內(nèi)乳酸菌含量明顯增加，而大腸桿菌、沙門氏菌、梭菌及腸球菌的含量明顯減低，且可顯著緩解犬的腹瀉。為篩選犬用益生菌制劑的候選菌株，從散養(yǎng)的健康成年中華田園犬糞便中分離、鑒定出3株乳酸桿菌。采用耐酸、抗膽鹽、細胞黏附、抑菌和小鼠口服促生長等益生特性試驗，探討3株乳酸桿菌作為益生菌的可能性，以期為犬用益生菌制劑候選菌株的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品與菌株

樣品采自泰州市郊區(qū)村民散養(yǎng)的健康成年中華田園犬新鮮糞便。犬源致病性大腸桿菌菌株201，由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院教學(xué)動物醫(yī)院實驗室分離、鑒定保存。

1.2 供試動物

健康KM小鼠，體質(zhì)量(20.00±0.20)g，購自揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心。

1.3 主要試劑

乳酸桿菌用成套生化鑒定管及MRS液體培養(yǎng)基、MRS固態(tài)培養(yǎng)基均購自海博生物技術(shù)有限公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA 膠回收試劑盒等均購自上海生工生物工程股份有限公司；CaCO3、Triton X-100(辛基苯基聚氧乙烯醚)、牛膽鹽等均購自北京索萊寶科技有限公司；LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基均購自O(shè)xoid公司。

1.4 菌株分離鑒定

1.4.1 樣品采集和菌株分離 無菌取健康成年田園犬新鮮糞便10 g加入滅菌蒸餾水90 mL，充分渦旋混勻，采用梯度稀釋法將樣品稀釋，分別取10-5～10-8稀釋度的樣品200 μL，涂布于含有0.75% CaCO3的改良MRS培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h 后觀察菌株生長情況，挑選形態(tài)不同且有明顯溶鈣環(huán)生成的菌落，在MRS平板上劃線培養(yǎng)3 次純化，將革蘭氏染色鏡檢陽性的菌落，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 生理生化鑒定 將純化后的菌株，參照文獻[11]方法進行過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗、硫化氫試驗和糖發(fā)酵試驗等生理生化指標(biāo)測定。

1.4.3 16S rRNA基因序列分析 按照細菌DNA提取試劑盒提取分離菌株的總DNA，采用細菌16S rRNA基因通用引物27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492 R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。PCR 擴增體系(20 μL)：2Mix 10 μL，10 μL mol/L 的上下游引物各0.5 μL， DNA 模板5 μL，ddH2O 4 μL。PCR 擴增條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，57 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃ 保存。將擴增產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測序，將測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的參考菌株序列進行同源性比對，最終確定所分離的3株分離菌株的屬種。

1.5 分離菌株的益生特性

1.5.1 對酸的耐受性 將凍存復(fù)蘇后的分離菌株，以5% 的接種量分別接種于pH值1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃ 條件下100 r/min培養(yǎng)3 h，用分光光度計測其OD600。

1.5.2 對膽鹽的耐受性 將凍存復(fù)蘇后的分離菌株，以5%的接種量分別接種于含牛膽鹽0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃條件下100 r/min培養(yǎng)3 h，用分光光度計測定其OD600。

1.5.3 對犬源致病性大腸桿菌的抑制作用 參照文獻[12]采用牛津杯法。取復(fù)蘇至對數(shù)期的大腸桿菌200 μL，涂布于LB固體培養(yǎng)基平板，4 ℃ 擴散吸收2 h。待菌液完全吸收后，在每個平板上放置3個已滅菌的牛津杯。將培養(yǎng)24 h后的乳酸桿菌，8 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，收集上清液，每種菌株分別取上清液2份，1份測定pH值作為原液，1份調(diào)節(jié)pH值至6.5，2份上清均用0.22 μm的濾膜過濾除菌。分別取每種分離菌的2份上清濾液各200 μL，加入到3個牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)12 h后測量抑菌圈直徑。

1.5.4 對腸黏膜上皮細胞黏附能力測定 參照文獻[13]方法，選擇出生后未吃初乳的田園幼犬，無菌操作剪開小腸，用pH值7.2的PBS洗去內(nèi)容物，將干凈小腸浸于PBS中，4 ℃放置30 min。取出小腸，PBS洗滌3次，用無菌載玻片邊緣將腸黏膜上皮細胞輕輕刮下，懸浮于PBS 液中，調(diào)整細胞數(shù)量至1×105個/mL，無菌備用。將培養(yǎng)18 h后的3株分離菌，4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，將菌體用PBS重懸，使菌數(shù)量達1×107cfu/mL。分別取1 mL 乳酸桿菌懸液與1 mL腸上皮細胞懸液，加入已放置細胞爬片的試管中混合，在37 ℃條件下 20 r /min 作用30 min，棄去混合液，加入PBS液洗滌2次，然后加入2 mL 含有0.1% Triton X-100的PBS，使細胞裂解10 min。將細胞裂解液用PBS進行10倍稀釋，在MRS 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后進行細菌計數(shù)，每個稀釋重復(fù)3次。計算黏附率：黏附率=(細胞裂解后的細菌數(shù)/加入到試管中的細菌數(shù))×100%。

1.5.5 對小鼠的安全性與促生長作用 將分離菌接種于MRS肉湯中培養(yǎng)24 h，3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入無菌的生理鹽水至原體積，重復(fù)洗滌3次。配制成1×109cfu/mL菌液，按菌種編號對28日齡小鼠進行分組，每組10只，每只分別灌服0.2 mL菌液，每天灌服1次，共28 d。對照組小鼠灌服等體積的生理鹽水，每天觀察小鼠精神狀態(tài)、飲食及死亡情況，每周稱體質(zhì)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)特征

將稀釋后的新鮮糞便，采用0.75% CaCO3的MRS改良瓊脂培養(yǎng)基，分離出3株形態(tài)不同且具有明顯融鈣環(huán)的乳酸桿菌，革蘭氏染色均為陽性，無鞭毛和芽孢(圖1)。TCSL1菌體呈短桿狀，兩端圓形，單獨或成對存在；TCSL2呈球狀、短鏈狀；TCSL3呈長桿狀。

圖1 3株乳酸桿菌形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of three strains of Lactobacillus

2.2 分離菌株的生理生化鑒定

從表1可以看出，3株分離菌株過氧化氫酶試驗、硝酸鹽試驗、硫化氫試驗均為陰性，乳糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖等發(fā)酵試驗均為陽性，符合乳酸桿菌的生理生化特征。

表1 3株乳酸桿菌生理生化鑒定Tab.1 Physiological and biochemical identification of three strains of Lactobacillus

2.3 分離菌株的16S rRNA 基因序列分析

3株分離菌均擴增出約1 500 bp 的16S rRNA 基因片段(圖2)。測序結(jié)果經(jīng)BLAST 軟件同源性比對分析，TCSL1 與唾液乳酸桿菌(L.salivarius)的16S rRNA的相似性達99.6%，TCSL2 與約氏乳酸桿菌(L.johnsonii)的16S rRNA 的相似性達99.4%，TCSL3與瑞氏乳酸桿菌(L.helveticus)的16S rRNA的相似性達99.1%。結(jié)合形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定結(jié)果，將TCSL1鑒定為唾液乳酸桿菌(L.salivarius)，TCSL2 鑒定為約氏乳酸桿菌(L.johnsonii)，TCSL3鑒定為瑞氏乳酸桿菌(L.helveticus)。

M．DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1．唾液乳酸桿菌(TSL1)；2．約氏乳酸桿菌(TSL2)；3．瑞士乳酸桿菌(TSL3)M．DNA Marker DL2000；1．L.salivarius(TSL1)；2．L.johnsonii(TSL2)；3．L.helveticus(TSL3)圖2 3株乳酸桿菌16S rRAN PCR結(jié)果Fig.2 16S rRAN PCR results of three strains of Lactobacillus

2.4 分離菌株的益生特性

2.4.1 對酸的耐受性 將3株分離菌株接種到不同pH值的MRS液體培養(yǎng)基中，測定其對酸的耐受性。由圖3可知，3株分離菌株在pH值1.0的酸性環(huán)境中生長受到抑制，在pH 值2.0時緩慢生長，當(dāng)pH值達到3.0時開始快速生長，至pH值為6.0時達到峰值，表明3株分離菌株均能耐受pH值2.0以上的酸性環(huán)境。TCSL1和TCSL3對酸的耐受性優(yōu)于TCSL2。

圖3 3株乳酸桿菌在不同pH值培養(yǎng)基中的生長情況Fig.3 Growth of three strains of Lactobacillus in different pH value medium

2.4.2 對膽鹽的耐受性 將3株分離菌株接種到不同含量牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，測定其對膽鹽的耐受性。由圖4可知，TCSL1含量在0.4%、TCSL2和TCSL3含量在0.3% 時，OD600值達到峰值，之后隨牛膽鹽含量的升高，3株菌的生長均受到抑制；當(dāng)牛膽鹽含量達到0.6%時，3株菌的OD600值與牛膽鹽含量0.1% 時接近，表明3株分離菌株在含0.6%牛膽鹽的MRS培養(yǎng)基中均能存活。

圖4 3株乳酸桿菌在含牛膽鹽培養(yǎng)基中的生長情況Fig.4 Growth of three strains of Lactobacillus in culture containing bile salt

2.4.3 對犬源致病性大腸桿菌的抑菌作用 由表2可知，TCSL1、TCSL2和TCSL3培養(yǎng)24 h未調(diào)節(jié)pH時的上清液(原液)和上清液(調(diào)節(jié)pH值至6.5)，對犬源致病性大腸桿菌均具有顯著的抑制作用，上清液(原液)的抑菌效果優(yōu)于調(diào)節(jié)pH值至6.5后的上清液。

表2 3株乳酸桿菌發(fā)酵液上清液對犬致病性大腸桿菌抑菌圈直徑Tab.2 Diameter of bacteriostatic circle of the three Lactobacillus supernatant on pathogenic Escherichia coli in dogs mm

2.4.4 對犬小腸上皮細胞的黏附力 3株分離菌與犬小腸上皮細胞混合30 min后，表現(xiàn)出了較強的黏附能力，TCSL1、TCSL2和TCSL3對犬小腸上皮細胞黏附率均達到65%以上，TCSL2黏附率最高為77.41%(圖5)。

2.4.5 對小鼠安全性與體質(zhì)量的影響 將3分離菌株菌給小鼠連續(xù)灌服28 d，期間各組小鼠精神良好，采食正常，無死亡，安全性較好。由表3可知，與對照組相比，TCSL1菌株接種小鼠從14 d開始，TCSL2菌株從21 d開始，小鼠體質(zhì)量顯著上升(P<0.05)，TCSL3菌株接種小鼠體質(zhì)量無明顯變化。結(jié)果表明，TCSL1和TCSL2菌株均能促進小鼠的生長。

圖5 3株乳酸桿菌對犬上皮細胞的黏附力Fig.5 Adhesion of three strains of Lactobacillus to canine epithelial cells

表3 3株乳酸桿菌對小鼠體質(zhì)量的影響Tab.3 Effect of three Lactobacillus strains on the body weight of mice g

3 結(jié)論與討論

從犬的腸道或糞便中分離乳酸桿菌是篩選犬用益生菌制劑候選菌株的重要途徑。研究表明，已從犬的糞便中分離出了多種具有益生作用的乳酸桿菌，如羅伊氏乳酸桿菌(L.reuteri)AI[14]和X-18[15]、約氏乳酸桿菌(L.johnsonii)CPN23[16]、唾液乳酸桿菌(L.salivarius)LAB9[17]、植物乳酸桿菌(L.plantarum)VET14A[18]等。本研究從犬糞便中分離篩選出了3株乳酸桿菌，經(jīng)生理生化和16S rRNA序列分析鑒定為唾液乳酸桿菌、約氏乳酸桿菌和瑞士乳酸桿菌。本次分離的乳酸菌種類與KIM等[19]報道犬腸道內(nèi)的乳酸桿菌種類主要為羅伊氏乳酸桿菌(L.reuteri)、動物乳酸桿菌(L.animalis)和約氏乳酸桿菌(L.johnsonii)，分別以77.8%、80.6%和86.1%的頻率出現(xiàn)，有差異。犬源瑞士乳酸桿菌(L.helveticus)分離出的幾率較低，僅全志海[8]報道從犬腸道和糞便篩選出了1株瑞士乳酸桿菌。乳酸桿菌種類出現(xiàn)差異的原因可能與分離犬的種類、飼養(yǎng)方式、分離方法等不同有關(guān)。

口服是乳酸桿菌作為益生菌菌株進入動物胃腸道的主要途徑，而低pH值的胃酸和腸道內(nèi)膽汁中的膽鹽，食物通過胃腸道的時間等因素均能影響其存活，因此對酸和膽鹽的耐受性是評價益生乳酸桿菌的重要指標(biāo)[20]。本研究結(jié)果表明，3 株乳酸桿菌經(jīng)過3 h 的不同pH值和不同含量的牛膽鹽處理后，均能耐受pH 值2.0以上的酸性環(huán)境和0.6% 的牛膽鹽，其中，以唾液乳酸桿菌的耐受性最好。劉小蘭等[21]報道,從雞腸道內(nèi)分離出唾液乳酸桿菌，其對酸的耐受性與本研究結(jié)果相一致，而耐膽鹽結(jié)果則不一致。從犬糞便中分離的唾液乳酸桿菌對牛膽鹽的耐受能力較強，在0.1%～0.4% 低含量時能促進其生長，而從雞腸道內(nèi)分離的唾液乳酸桿菌對膽鹽的耐受能力稍差，其存活率隨膽鹽含量的升高而降低，其差異可能是乳酸桿菌的分離來源不同。犬源瑞士乳酸桿菌對酸的耐受性結(jié)果與朱炳林等[22]從豬腸道內(nèi)分離的瑞士乳酸桿菌一致，均能耐受pH值 2.5以上。食物通過胃腸道的時間通常為1～2 h[23]。本研究得到的3 株乳桿菌均具有較強的耐酸耐膽鹽能力，在經(jīng)過酸、膽鹽處理3 h時后仍能保持較好的生長狀態(tài)，顯示出作為益生菌菌株的潛力。

乳酸桿菌在代謝過程中產(chǎn)生的乳酸、細菌素和過氧化氫等活性物質(zhì)，可顯著降低環(huán)境pH值和氧化還原點位值，從而使腸內(nèi)酸度增高，能夠抑制大腸桿菌類和沙門氏菌等病原菌，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，借以預(yù)防腹瀉或緩解相應(yīng)癥狀[24]。本研究中，培養(yǎng)24 h后的3株乳酸桿菌發(fā)酵上清液為酸性，其pH值在3.25～3.71。將pH值調(diào)至6.5后，對犬源致病性大腸桿菌仍具有顯著的抑制作用。結(jié)果表明，3株乳酸桿菌的抑菌活性物質(zhì)不僅有代謝產(chǎn)生的乳酸，可能也有細菌素或過氧化氫等其他活性成分。試驗結(jié)果與鄒建華等[25]分離的雞源唾液乳酸桿菌對致病性大腸桿菌有抑菌作用一致，且抑菌效果更好，其差異可能與唾液乳酸桿菌的分離來源和作用的大腸桿菌種類不同有關(guān)，本研究選用的致病性大腸桿菌來源于腹瀉的病犬，抑制作用更具有針對性。3株乳酸桿菌發(fā)酵上清液中的何種物質(zhì)在抑菌活性中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用，其機制有待進一步研究。

乳酸桿菌能黏附定植在腸黏膜上皮細胞上是其發(fā)揮益生作用的關(guān)鍵因素之一，不能黏附于腸上皮細胞，僅是過路菌，則隨糞便排出[26]。作為優(yōu)良益生菌株必須具有較好的黏附性，才能在維持腸道正常菌群的生理平衡和抵御外來病原菌的入侵等方面發(fā)揮益生作用。本研究選用出生后未吃初乳的田園幼犬小腸上皮細胞，與分離的乳酸桿菌體外作用后檢測其黏附能力，結(jié)果表明，3株乳酸桿菌對犬小腸上皮細胞均具有較好的黏附作用，其中唾液乳酸桿菌的黏附率最高為77.41%。本試驗參照李太元等[13]的方法并做改進，既兼顧了直接染色觀察乳酸桿菌細胞黏附狀態(tài)的優(yōu)點，又增添了計算黏附率評價乳酸桿菌黏附能力的相對客觀性。采用新鮮分離的幼犬上皮細胞，雖然細胞來源簡便，但與乳酸桿菌體外黏附的過程中由于沒有添加細胞培養(yǎng)液，細胞的體外存活率會受到影響，進而影響到乳酸桿菌的黏附能力，因此，體外黏附試驗作用時間應(yīng)縮短，選擇30 min較為適宜。

乳酸桿菌在代謝過程中產(chǎn)生的乳酸不僅能改變腸道的pH值環(huán)境，發(fā)揮抑菌作用，同時能促使胃蛋白酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槲傅鞍酌?，提高胃蛋白酶的活性，促進動物對蛋白質(zhì)的消化吸收，從而提高飼料報酬，改善動物生長性能[27]。本研究選用28日齡小鼠作為動物模型，觀察了3株乳酸桿菌的飼用安全性和促生長作用。結(jié)果表明，給小鼠連續(xù)28 d 口服3株乳酸桿菌，試驗過程中無小鼠死亡，且唾液乳酸桿菌和約氏乳酸桿菌對小鼠生長有顯著的促進作用。研究結(jié)果與楊紅亞等[28]報道的約氏乳酸桿菌能顯著提高雛雞體質(zhì)量的作用相一致。受供試動物條件限制，本研究并未選擇犬作為動物模型，乳酸桿菌來源與試驗對象不一致，可能對試驗結(jié)果會有影響，但也從側(cè)面反映了3株乳酸桿菌具有較強的體內(nèi)益生作用。

綜上，本研究從散養(yǎng)健康的中華田園犬糞便中分離得到了唾液乳酸桿菌、約氏乳酸桿菌和瑞士乳酸桿菌，3株乳酸桿菌對酸、膽鹽耐受性好，能抑制犬源致病性大腸桿菌，對犬小腸上皮細胞的黏附能力強且能促小鼠生長，顯示出較好的益生特性，可作為犬用益生菌制劑候選菌株開展進一步研究。