褪黑素在葡萄上應(yīng)用研究進(jìn)展

趙艷俠，吳新穎，王鵬飛，亓桂梅

(山東省葡萄研究院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100)

褪黑素是一種吲哚胺類激素，1958年首次從牛的松果體中分離出來(lái)，并鑒定出其化學(xué)結(jié)構(gòu)[1]。在植物界中，1991年首次在單細(xì)胞藻類(Gonyaulaxpolyedra)中鑒定出褪黑素，之后又在洋蔥、菠蘿、卷心菜、黃瓜、草莓等多種植物中鑒定和檢測(cè)到褪黑素[2]。褪黑素具有抗氧化的性質(zhì)，可以清除有機(jī)體內(nèi)的活性氧和活性氮自由基[3-4]。目前，動(dòng)物中褪黑素合成路徑已經(jīng)比較清楚，由色氨酸脫羧酶(TDC)、色胺-5-羥化酶(T5H)、5-羥色胺-N-乙?；D(zhuǎn)移酶(SNAT)、N-乙?；?5-羥色胺-甲基轉(zhuǎn)移酶(ASMT)4種酶參與酶促反應(yīng)將色氨酸轉(zhuǎn)化為褪黑素[5]，但是植物中褪黑素合成路徑還尚不明確，目前已知植物中五羥色胺是褪黑素的合成前體[6]，褪黑素代謝產(chǎn)物有2-羥基褪黑素(99%)、4-羥基褪黑素、6-羥基褪黑素[7]。這些代謝產(chǎn)物的相同點(diǎn)是褪黑素的合成前體物質(zhì)都是色氨酸[8]，但是在植物上合成路徑更為復(fù)雜，不僅僅有TDC、T5H、SNAT和ASMT參與酶促反應(yīng)，還存在色氨酸羥化酶(TPH)等參與其他合成通路[9-10]。SNAT基因在褪黑素的合成路徑中能夠催化五羥色胺轉(zhuǎn)化成N-乙酰-5-羥色胺。不同植物SNAT的氨基酸序列均具有一定的同源性，而褪黑素合成路徑中TDC、T5H、ASMT基因在不同植物中序列保守性較低[11]，葡萄上褪黑素合成關(guān)鍵酶基因VvTDC、VvSNAT等已經(jīng)得到克隆，但在葡萄上褪黑素合成關(guān)鍵基因的組織定位及亞細(xì)胞定位分析還不明確。目前只發(fā)現(xiàn)褪黑素生物合成途徑中間產(chǎn)物存在于細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體等亞細(xì)胞組分中[12]。

許多報(bào)道表明，褪黑素不僅具有抗氧化性，而且能夠減輕環(huán)境脅迫的影響，如溫度、干旱、紫外線-B(UV-B)和重金屬污染等。與此同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)環(huán)境脅迫可增加植物內(nèi)源褪黑素的含量。對(duì)褪黑素在葡萄上的含量、分布及功能等研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為褪黑素在葡萄上應(yīng)用和系統(tǒng)研究提供一定理論參考。

1 不同品種和發(fā)育時(shí)期葡萄褪黑素含量

1.1 品種

褪黑素在不同葡萄品種中的含量存在差異。2006年 IRITI等[13]首次利用高效液相色譜法(HPLC)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定內(nèi)比奧羅(Nebbiolo)、克羅蒂娜(Croatina)、桑嬌維賽、美樂(lè)、瑪澤米諾(Marzemino)、品麗珠、赤霞珠和巴貝拉(Barbera)等8個(gè)不同品種葡萄果皮中褪黑素的濃度，結(jié)果顯示，不同葡萄品種果皮中的褪黑素含量存在差異，含量為0.005～0.965 ng/g，褪黑素含量較高的2個(gè)品種是內(nèi)比奧羅(0.965 ng/g)和克羅蒂娜(0.870 ng/g)。STEGE等[14]則利用毛細(xì)管層析方法檢測(cè)馬貝克、赤霞珠、霞多麗葡萄果皮中褪黑素含量分別為0.6、0.8、1.2 ng/g。卞鳳娥[15]測(cè)定12個(gè)葡萄品種成熟果皮中褪黑素含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分含量在1 ng/g以內(nèi)，美樂(lè)葡萄果皮中的褪黑素含量最高，其次是馬貝克、威代爾等，而摩爾多瓦、早巨峰、香百川等含量較低?？偟膩?lái)說(shuō)，大多數(shù)葡萄中的褪黑素含量存在品種間差異。

1.2 發(fā)育時(shí)期

葡萄不同發(fā)育時(shí)期的內(nèi)源褪黑素含量不同，在果實(shí)的不同發(fā)育階段均檢測(cè)到褪黑素的存在，且褪黑素含量表現(xiàn)出明顯差異。一般而言，葡萄轉(zhuǎn)色前的綠果期褪黑素含量相對(duì)較高，隨著果實(shí)轉(zhuǎn)色褪黑素含量升高，轉(zhuǎn)色初期果實(shí)中褪黑素含量達(dá)到最高峰，隨著果實(shí)完全轉(zhuǎn)色褪黑素含量下降，隨著果實(shí)逐漸成熟又表現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。其合成前體物質(zhì)——色胺和五羥色胺含量變化趨勢(shì)與褪黑素一致，均在轉(zhuǎn)色初期含量最高[16]，而種子中的褪黑素含量在轉(zhuǎn)色期達(dá)到最高[17]。果實(shí)的成熟程度也對(duì)褪黑素含量存在一定的影響，葡萄上褪黑素合成關(guān)鍵酶基因VvSNAT1、VvSNAT2、VvSNAT3在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量變化趨勢(shì)相似，在果實(shí)轉(zhuǎn)色初期表達(dá)量達(dá)到最高峰，轉(zhuǎn)色后期表達(dá)量下降，隨著果實(shí)逐漸成熟，VvSNAT1、VvSNAT2、VvSNAT3表達(dá)量又上升，這3個(gè)基因在葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)量與褪黑素含量變化趨勢(shì)基本一致[18]。

2 褪黑素在葡萄生長(zhǎng)發(fā)育中的作用

越來(lái)越多的證據(jù)表明，褪黑素調(diào)控植物多種生理過(guò)程，如種子萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)成熟以及采后成熟和果實(shí)質(zhì)量改善等[19-24]。褪黑素對(duì)葡萄的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，葡萄幼果噴施褪黑素溶液，可引起葡萄果實(shí)內(nèi)源褪黑素積累，促進(jìn)果實(shí)膨大[25]。外源褪黑素處理能極顯著提高果實(shí)內(nèi)源褪黑素含量，提高總花青苷和可溶性固形物含量，降低可滴定酸含量，表明褪黑素促進(jìn)葡萄果實(shí)成熟[20]。葡萄中褪黑素的合成存在晝夜節(jié)律現(xiàn)象，尤其是光和溫度也能夠影響植物體內(nèi)褪黑素的合成與積累[26]。BOCCALANDRO等[27]分析不同時(shí)間段葡萄果實(shí)中褪黑素含量，發(fā)現(xiàn)黎明之前果實(shí)中含量最高，可能受光照和溫度的影響，夜間褪黑素含量高于白天。發(fā)育的花和種子存在高濃度的褪黑素，可以起到保護(hù)生殖器官的作用，褪黑素含量隨著美樂(lè)葡萄果實(shí)的成熟不斷增加[18]。

3 褪黑素在葡萄抗性調(diào)控中的作用

葡萄中褪黑素的合成是其對(duì)逆境脅迫的一種應(yīng)激響應(yīng)，褪黑素在緩解逆境脅迫方面具有重要作用。葡萄通過(guò)調(diào)節(jié)逆境脅迫下葉片光合速率、氣孔導(dǎo)度、細(xì)胞膜離子滲透率和細(xì)胞中抗氧化酶活性等生理特性，提高抵御脅迫的能力[28-30]。

3.1 參與鹽堿脅迫調(diào)控

鹽堿脅迫是一種限制葡萄生長(zhǎng)和生物合成的重要非生物脅迫。研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫后，葡萄根系中褪黑素含量大幅度下降，嫩枝中五羥色胺含量增加，脅迫嚴(yán)重抑制葡萄葉片光系統(tǒng)活性；根施外源褪黑素后與單純的鹽脅迫相比，促進(jìn)褪黑素在葡萄不同器官中代謝和分布，顯著提高葉片中五羥色胺含量和新根褪黑素含量，提高嫩梢和葉片中2-羥基褪黑素含量，褪黑素緩解葉片光系統(tǒng)活性抑制程度，減輕鹽脅迫對(duì)葡萄葉片光合作用的傷害程度，有效提高逆境脅迫下葉片光合色素含量和光合能力[31-32]。與受鹽脅迫類似，葡萄受堿脅迫后，葡萄根、莖和葉中的褪黑素含量降低，葡萄根系中褪黑素代謝前體物質(zhì)五羥色胺含量顯著增加，褪黑素的代謝產(chǎn)物2-羥基褪黑素含量在根中大幅降低，在葉片中大量積累，調(diào)節(jié)有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，堿脅迫下外源褪黑素顯著降低了葉片超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率和H2O2含量，增加有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量，通過(guò)上調(diào)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白VvNHXP和VvHKT家族基因的表達(dá)，維持胞內(nèi)離子平衡，緩解堿對(duì)膜系統(tǒng)的傷害[33]。另外，外源褪黑素處理可以清除堿脅迫下葡萄根中過(guò)量活性氧的累積，維持膜系統(tǒng)的完整性，提高根系活力，緩解堿脅迫對(duì)葡萄葉片葉綠素的降解以及光系統(tǒng)(PSⅡ)活性的抑制[34]。在鹽堿脅迫情況下，葡萄根系和葉片中的褪黑素對(duì)葡萄抵抗鹽堿脅迫起到重要的作用。

3.2 參與水分脅迫調(diào)控

干旱脅迫下，葡萄幼苗根系和葉片中褪黑素含量是正常生長(zhǎng)條件下幼苗根系和葉片中褪黑素含量的7倍，增加顯著；10% PEG-6000處理植株后其根系和葉片中褪黑素含量也遠(yuǎn)高于空白對(duì)照組，且脅迫程度越強(qiáng)增幅越大[35]。MENG等[36]發(fā)現(xiàn)，外源添加褪黑素可以緩解干旱脅迫對(duì)葡萄幼苗的傷害，還發(fā)現(xiàn)褪黑素能保護(hù)干旱脅迫下葡萄葉綠體膜結(jié)構(gòu)和基粒片層結(jié)構(gòu)，增加葉片厚度和柵欄組織緊實(shí)度，并調(diào)控氣孔關(guān)閉以降低水分散失。外源褪黑素可以提高干旱脅迫下葡萄內(nèi)源褪黑素含量及其關(guān)鍵代謝物五羥色胺與2-羥基褪黑素含量，緩解脅迫對(duì)葉片光抑制的作用[37]。

3.3 參與溫度和臭氧脅迫調(diào)控

研究發(fā)現(xiàn)，根施褪黑素可顯著緩解葡萄葉片凈光合速率及最大光化學(xué)效率的下降程度，改善高溫脅迫下葡萄葉片的能量分配，增加葉片對(duì)光能的利用效率，有助于提高葡萄的耐熱性[25]。外源褪黑素在防御葡萄霜凍中也發(fā)揮作用，在輕度低溫脅迫下噴施褪黑素可以減輕葡萄葉片受凍程度，減輕葡萄葉片細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度，保護(hù)膜的完整性，減少電解質(zhì)的外滲，效果與碧護(hù)(植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)及天達(dá)(植物細(xì)胞膜穩(wěn)態(tài)劑)類似[38]。耿慶偉等[30]研究顯示，外源褪黑素提高臭氧脅迫下葡萄葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量以及葉綠素a/b值，通過(guò)調(diào)節(jié)光系統(tǒng)的能量分配，緩解臭氧脅迫下葉片的氧化損傷程度，提高光保護(hù)機(jī)制，保護(hù)葉片光合功能。

4 褪黑素與其他激素的協(xié)同作用

褪黑素在結(jié)構(gòu)上與植物激素IAA(吲哚-3-乙酸)相似，同為吲哚胺類化合物，褪黑素和生長(zhǎng)素的生物合成途徑具有相同的前體色氨酸[5,8]，其共同的前體物質(zhì)色氨酸可用于產(chǎn)生更多的褪黑素，降低生長(zhǎng)素的合成，從而發(fā)揮調(diào)控果實(shí)發(fā)育的作用[39-40]，所以一些研究圍繞著生長(zhǎng)素在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用展開(kāi)。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素及其前體物質(zhì)五羥色胺促進(jìn)根系生長(zhǎng)，與生長(zhǎng)素作用模式類似[41],促進(jìn)下胚軸的生長(zhǎng)類似于IAA[40]。目前在葡萄上關(guān)于褪黑素與其他激素的交互研究較少。許麗麗等[42]在葡萄上展開(kāi)一些研究，發(fā)現(xiàn)褪黑素處理顯著誘導(dǎo)乙烯生化合成和信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，提高轉(zhuǎn)色期葡萄果實(shí)中乙烯前體物質(zhì)1-氨基環(huán)丙烷羧酸(ACC)含量和乙烯釋放速率，對(duì)ABA(脫落酸)含量未產(chǎn)生顯著影響。褪黑素可能與乙烯相互作用促進(jìn)了葡萄果實(shí)的成熟。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素處理誘導(dǎo)葡萄果實(shí)中33個(gè)葡萄茋類合酶基因Sts上調(diào)表達(dá)，在上調(diào)33個(gè)Sts基因啟動(dòng)子區(qū)存在脫落酸、乙烯、水楊酸和生長(zhǎng)素等激素響應(yīng)元件和MYB結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)褪黑素具有不同的表達(dá)響應(yīng)模式，進(jìn)而提高葡萄白藜蘆醇含量[43]。褪黑素和ACC增強(qiáng)葡萄對(duì)鹽的耐受性，并且乙烯參與褪黑素誘導(dǎo)的耐鹽性。進(jìn)一步的研究表明，外源褪黑素處理和內(nèi)源褪黑素的增加，通過(guò)MYB108A對(duì)ACS1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)促進(jìn)葡萄乙烯的生物合成和耐鹽性提高[44]。

5 展望

褪黑素在葡萄上的應(yīng)用已經(jīng)開(kāi)展一段時(shí)間，因?yàn)槠淅砘再|(zhì)不穩(wěn)定，在組織器官確切合成位置仍不明確，植株感受褪黑素的受體及結(jié)合位點(diǎn)仍屬未知，植物細(xì)胞中褪黑素特異受體仍是研究的重要方面。褪黑素作為一種植物激素，與其他激素的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)仍需進(jìn)一步明確。關(guān)于葡萄褪黑素的研究多集中在其對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其生物合成方面，較少集中在基因表達(dá)的研究層面。褪黑素與其他激素協(xié)同作用在擬南芥等模式植物上研究較多，但是葡萄基因組更為復(fù)雜，在葡萄上褪黑素與其他激素協(xié)同作用仍是未來(lái)研究的重點(diǎn)。