麗江山慈菇藥材鑒別方法改進(jìn)

黃云先　劉云懷　楊光榮

摘要：目的對麗江山慈菇標(biāo)準(zhǔn)中鑒別方法改進(jìn)。方法用顯微及專屬性強(qiáng)的秋水仙堿對照品TLC薄層鑒別。結(jié)果顯微鑒定作為鑒別中藥、中成藥的手段之一，其方法可變性不強(qiáng)、操作簡便、而特異性較強(qiáng)，薄層鑒別引進(jìn)代表性成份秋水仙堿對照品進(jìn)行定性。結(jié)論改進(jìn)方法簡便、快捷，準(zhǔn)確度高，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可用于麗江山慈菇藥材的鑒別及質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：麗江山慈菇;TLC薄層色譜鑒別;秋水仙堿;顯微鑒別

中圖分類號：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1007-2349（2020）04-0080-04

麗江山慈菇是百合科植物山慈菇Iphigenia indica Kunth的鱗莖[7]。又名山慈菇、土貝母、草貝母、假貝母、鬧狗藥[1]、苦子、光苦子、益辟堅(jiān)[3]、光慈菇[5]。云南省地方習(xí)用藥材，為納西族、白族、彝族常用藥材。載于《本草遺拾》，為《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》（1974年版、1996年版）、《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2005年版第二冊·彝族藥收載品種。與《中國藥典》（2015年版一部）收載“山慈菇”比較，來源系不同科屬植物，為與國家標(biāo)準(zhǔn)相區(qū)別，謂之“麗江山慈菇”。是云南通用善美制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)的“乳癖清膠囊（國藥準(zhǔn)字Z20025068）”的原料藥之一。麗江山慈菇還是提制秋水仙堿的主要原料?！对颇鲜≈兴幉臉?biāo)準(zhǔn)》2005年版第二冊·彝族藥中對麗江山慈菇的鑒別對照藥材薄層色譜鑒別，本文參照文獻(xiàn)[6]，通過對云南省麗江古城區(qū)和玉龍縣及大理4個(gè)批次的麗江山慈菇樣品做了顯微鑒別及專屬性較強(qiáng)的成分秋水仙堿的薄層色譜鑒別，以建立一個(gè)專屬性更強(qiáng)的鑒別方法，從面達(dá)到控制麗江山慈菇藥材質(zhì)量的目的。

1儀器與實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器德國塞多利斯BT224S電子分析天平;梅特勒MS205DU電子分析天平;Purelab Flex 超純水機(jī)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1試藥試劑秋水仙堿（C22H25NO6）對照品適量（中國食品藥品檢定研究院，批號：101176-201202，按93.6%計(jì)）;甲苯、丙酮、甲醇、三氯甲烷、環(huán)己烷（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）;水（實(shí)驗(yàn)室自制UP水，Ω=18.3）;硅膠GF254薄層板（青島海洋化工）;硅膠G薄層板（青島海洋化工）;硅膠G薄層板（美國莫克）。

1.2.2樣品來源麗江山慈菇樣品購買、采集麗江古城區(qū)、玉龍縣及大理樣品共4個(gè)。

L01，2015年8月，采自麗江市玉龍縣龍?bào)脆l(xiāng)新文村;為野生品;為干燥花期全株。

L02，2015年9月，采自麗江市古城區(qū)金山鄉(xiāng)東河村;為野生品;為干燥果期全株。

L03，2015年9月，購自麗江市古城區(qū)象山市場，為大理州鶴慶縣野生品;為干燥藥材球莖。

L04，2015年10月，購自麗江市玉龍縣龍?bào)脆l(xiāng)新文村藥農(nóng)嚴(yán)四軍，為其采挖的當(dāng)?shù)匾吧?為干燥藥材球莖。

2方法與結(jié)果

2.1顯微鑒別本品球莖橫切面：表皮細(xì)胞1列，細(xì)胞扁平，長30～60μm，厚18～23μm，外被角質(zhì)層。其內(nèi)側(cè)為寬廣的薄壁組織，薄壁組織中充滿淀粉粒。維管束稀疏散在，外韌型，導(dǎo)管3～7個(gè)，環(huán)紋或網(wǎng)紋，導(dǎo)管常伴2～3個(gè)纖維。（自擬方法）（見圖1）。

本品粉末類白色。淀粉粒眾多，多為單粒，呈不規(guī)則球形、類圓形或盔帽形，直徑4～35μm，少數(shù)為2～3復(fù)粒，臍點(diǎn)呈裂縫狀或星狀。導(dǎo)管環(huán)紋、螺紋或網(wǎng)紋，直徑9～45μm（自擬方法），（見圖2a-d）。

2.2薄層鑒別（原標(biāo)準(zhǔn)方法）取本品粉末2 g，加濃氨水1mL，三氯甲烷25mL，振搖，放置過夜，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)尤燃淄?mL使溶解，作為供試品溶液。另取麗江山慈菇對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮-甲醇（6：3：1）為展開劑，另取氨水置展開缸中，預(yù)飽和15 min，展開，取出，晾干，置365 nm紫外光燈下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。再噴以改良碘化鉍鉀試液，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，（見圖3）。

2.3薄層鑒別（自擬方法）本品粉末1 g，加50%甲醇20 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取麗江山慈菇對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。再取秋水仙堿對照品，加甲醇制成每1 mL含秋水仙堿0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部0502）試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254 nm薄層板上，以三氯甲烷-環(huán)己烷-甲醇（10：2：1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視，樣品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的萃滅斑點(diǎn)，（見圖4）。

3分析方法驗(yàn)證

3.1薄層鑒別2.3中樣品溶液制備試驗(yàn)篩選方法1：取本品粉末1 g，加甲醇20 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

方法2：取本品粉末1 g，加乙醇20 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。

方法3：取本品粉末1 g，加50%甲醇20 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

方法4：取本品粉末1 g，加50%乙醇20 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

方法5：取本品粉末1 g，加70%甲醇20 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

方法6：取本品粉末1 g，加70%乙醇20 mL，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

通過實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)方法3操作可行性高，分離效果良好，方法驗(yàn)證效果良好，決定選用方法3為最終供試品制備方法。

3.2展開劑篩選展開劑1 三氯甲烷-丙酮-甲醇（6：3：1）

展開劑2：三氯甲烷-甲醇（10：1）

展開劑3：三氯甲烷-甲醇（10：3）

展開劑4：三氯甲烷-甲醇（19：1）

展開劑5：三氯甲烷-環(huán)己烷（10：1）

展開劑6：三氯甲烷-環(huán)己烷（10：3）

展開劑7：三氯甲烷-環(huán)己烷-甲醇（6：3：1）

展開劑8：三氯甲烷-環(huán)己烷-甲醇（10：1：1）

展開劑9：三氯甲烷-環(huán)己烷-甲醇（10：2：2）

展開劑10：三氯甲烷-環(huán)己烷-甲醇（10：2：1）

展開劑11：三氯甲烷-環(huán)己烷-甲醇（10：3：1）

通過比對用展開劑10號展開時(shí)RF值為0.37，在0.2～0.8藥典規(guī)定的范圍，展開效果好。

3.3檢視方法的選擇（1）紫外光燈（254nm）下檢視;（2）紫外光燈（365nm）下檢視;（3）噴以改良碘化鉍鉀試液顯色;（4）噴以飽和三氯化銻三氯甲烷溶液顯色。選用上述了四種方法檢視，第一法斑點(diǎn)清晰且方法簡便。

3.4點(diǎn)樣方式及點(diǎn)樣量考察點(diǎn)樣方式為接觸點(diǎn)樣;點(diǎn)樣量為2 μL、4 μL、5 μL、6 μL、8 μL、10 μL。溫度及相對濕度的影響 按照試驗(yàn)所得薄層色譜條件，考察本品在溫度5℃～30℃、相對濕度10%～75%展開時(shí)，對薄層色譜結(jié)果的影響。結(jié)果表明，在上述溫度、濕度范圍內(nèi)對該薄層色譜結(jié)果無明顯影響。

3.5預(yù)平衡試驗(yàn)按照試驗(yàn)所得薄層色譜條件，考察未平衡、平衡15 min、平衡30 min展開，對薄層色譜結(jié)果的影響。結(jié)果表明，平衡15 min比未平衡分離得好，平衡30 min展開時(shí)間太長。因此選用平衡15 min后展開。

3.6重復(fù)性不同產(chǎn)地的4批次樣品的檢測結(jié)果表明，該方法具有重復(fù)性。

4討論

試驗(yàn)表明，采用方法3制備供試品溶液，硅膠GF254薄層板，點(diǎn)樣量5 μL，以展開劑15 mL為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。所得薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離較好，易判斷結(jié)果，且重現(xiàn)性好。

顯微鑒定作為鑒別中藥、中成藥的手段之一，其方法可變性不強(qiáng)、操作簡便、而特異性較強(qiáng)，可以說利用顯微特征對比鑒定對大多數(shù)中藥材都行之有效。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，麗江慈菇山也不例外，的確具有其顯著的特異性。建議標(biāo)準(zhǔn)修訂時(shí)增加顯微鑒別。

原標(biāo)準(zhǔn)中鑒別項(xiàng)下未引進(jìn)代表性對照品進(jìn)行定性定量，考慮引進(jìn)仙水仙堿作為其代表性成分。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，新擬方法薄層色譜條件可行。建議標(biāo)準(zhǔn)修訂時(shí)增加現(xiàn)擬方法，應(yīng)與秋水仙堿對照品及麗江山慈菇對照藥材色譜相同。可見以秋水仙堿作為麗江山慈菇藥材標(biāo)識性成分有其合理性?？捎糜邴惤酱裙剿幉牡馁|(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)：

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[3]王國強(qiáng).全國中草藥匯編（卷二）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：543.

[4]中國藥用植物志編委會編.中國藥用植物志[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2014：106.

[5]有毒中草藥大辭典編輯委員會.有毒中草藥大辭典[M].天津：天津科技翻譯出版公司，1991：265.

[6]國家藥典委員會.中國藥典[S].四部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[7]云南省食品藥品監(jiān)督管理局.云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)[S].昆明：云南出版集團(tuán)公司云南科技出版社，2005：57.

（收稿日期：2019-12-23）

作者簡介：黃云先（1977-），女，本科，副主任藥師，研究方向：中藥材、中成藥及食品檢驗(yàn)。