萱草屬植物花蕾中的秋水仙堿HPLC測(cè)定

王金耀，黨換梅

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷 030801；2山西省設(shè)施蔬菜提質(zhì)增效協(xié)同創(chuàng)新中心）

萱草屬（Hemerocallis spp.）植物是百合科多年生宿根草本，多數(shù)分布于亞洲溫帶至亞熱帶地區(qū)，不僅具有觀賞價(jià)值，還具有較高食用價(jià)值[l,2]。萱草屬植物以其特有的觀花、食用、藥用等功能引起國(guó)內(nèi)外研究人員的重視，科學(xué)家們針對(duì)萱草屬植物的資源分布、繁殖育種、栽培應(yīng)用以及推廣等方面做了多方面研究[3]，隨著人們對(duì)萱草屬植物的深入研究，以及實(shí)際生活中食用萱草屬植物過(guò)稱中引發(fā)的中毒現(xiàn)象[4,5]，進(jìn)一步揭示了萱草屬植物中含有秋水仙堿。汪乃興、趙濱等以水為提取劑，利用差示脈沖極譜法在花蕾中檢測(cè)到秋水仙堿[6]。劉陳力為等在黃花菜中提取得到秋水仙堿[7]。

萱草屬植物因其含有秋水仙堿而造成鮮食時(shí)容易中毒，甚至危害生命。因此，針對(duì)萱草屬植物的蔬菜學(xué)評(píng)價(jià)中，秋水仙堿含量的高低直接影響其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的優(yōu)劣。本研究利用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定了2012年前后收集到的17份萱草屬植物中秋水仙堿含量，以期為萱草屬植物蔬菜學(xué)評(píng)價(jià)體系的建立提供依據(jù)。

表1 供試材料引種信息

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)供試材料取自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)萱草種質(zhì)資源圃（見(jiàn)表1），花期采收完整花蕾，45℃烘干，打磨成粉備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。準(zhǔn)確稱取秋水仙堿標(biāo)準(zhǔn)品20mg（純度98%），加入1mL色譜級(jí)甲醇配制成20mg/mL的儲(chǔ)備液，使用時(shí)吸取少量進(jìn)行稀釋。

1.2.2 色譜條件的確定。依據(jù)臺(tái)海川[8]采用RP-HPLC法建立秋水仙堿含量的測(cè)定體系（Waters C18（150mm×4.6mm，5um）、流動(dòng)相比例甲醇∶水=44∶56、流速 1 mL/min、柱溫 25℃、進(jìn)樣量20μL），對(duì)秋水仙堿的測(cè)定波長(zhǎng)進(jìn)行選擇與確定。在190～600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，確定其最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.3 樣品檢測(cè)。秋水仙堿提取采用超聲波提取法，含量測(cè)定采用高效液相色譜法[9]。參考課題組張寧建立的體系制備秋水仙堿待測(cè)樣[10]，利用Thermo Fisher U3000 HPLC高效液相色譜系統(tǒng)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化色譜測(cè)定條件

2.1.1 最優(yōu)檢測(cè)波長(zhǎng)檢測(cè)波長(zhǎng)的確定。利用HPLC對(duì)5μg/mL的秋水仙堿標(biāo)樣在設(shè)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)（190～600nm）進(jìn)行3D掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該標(biāo)準(zhǔn)樣品在243nm與350nm有最大吸收（見(jiàn)圖1）。5μg/mL秋水仙堿圖1標(biāo)準(zhǔn)樣的HPLC圖譜（243nm和350nm）標(biāo)準(zhǔn)溶液在243nm與350nm處的出峰時(shí)間分別為4.933min與4.923min，243nm處的峰高和峰面積分別為4.510和1.726，而350nm處的峰高和峰面積分別2.370和0.868，相比較可知，秋水仙堿在243nm處的靈敏度高。

進(jìn)一步分析色譜峰的峰型可以看出，標(biāo)準(zhǔn)溶液在243nm處檢測(cè)的所需組分（圖1中的組分5）峰前有1個(gè)小峰（組分4）干擾，而在350 nm處檢測(cè)出的秋水仙堿組分峰前沒(méi)有小峰干擾。為了避免干擾，減少誤差，提高試驗(yàn)方法與結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究選定350nm為秋水仙堿的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 秋水仙堿標(biāo)準(zhǔn)樣的HPLC圖譜

2.1.2 線性回歸關(guān)系線性關(guān)系考察。吸取少量?jī)?chǔ)備液，配制 0.1、0.2、0.3、0.4和0.5μg/mL的秋水仙堿標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到秋水仙堿標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的回歸曲線（見(jiàn)圖2），回歸方程為 Y=0.7939X-0.0218，R2=0.999。

圖2 秋水仙堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖3 標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試樣品的高效液相色譜圖

2.1.3 樣品測(cè)定。利用高效液相色譜法對(duì)秋水仙堿標(biāo)準(zhǔn)液和‘野生黃花1號(hào)’花蕾提取液進(jìn)行測(cè)定（見(jiàn)圖3）。由圖3可知，標(biāo)樣中秋水仙堿峰的出峰時(shí)間為4.920min，而在試樣中的出峰時(shí)間受到前后組分的影響而出峰時(shí)間提前為4.797min，但滿足出峰時(shí)間前后相差在5%的范圍。為進(jìn)一步對(duì)秋水仙堿組分進(jìn)行確定，在供試樣品提取過(guò)程中，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，對(duì)比保留時(shí)間是否出現(xiàn)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在試樣中加入一定濃度的秋水仙堿標(biāo)準(zhǔn)品，試樣仍然在同一時(shí)間（4.794min）出峰，但是信號(hào)值明顯提高，故可以確定試樣中的組分1和標(biāo)樣中的組分1同為秋水仙堿。

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

2.2.1 精密度試驗(yàn)。取20μL的0.5μg/mL秋水仙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液和‘金娃娃1號(hào)’溶液試樣連續(xù)進(jìn)樣7次，測(cè)定秋水仙堿含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.53%和1.23%，表明儀器進(jìn)樣的精密度能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取20μL的0.5μg/mL秋水仙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液和‘金娃娃1號(hào)’試樣溶液分別在0h、2h、4h、6h進(jìn)樣測(cè)定，標(biāo)樣與試樣中秋水仙堿含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為2.78%和3.35%；進(jìn)一步取20μL的0.5μg/m秋水仙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣（‘金娃娃1號(hào)’）溶液分別在0、1、2、3d進(jìn)樣測(cè)定，標(biāo)樣相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為2.96%，試樣相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為3.23%。結(jié)果表明，秋水仙堿含量在3d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 可行性分析。取20μL的0.5μg/m秋水仙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液和‘金娃娃1號(hào)’試樣溶液分別在45℃保溫箱與4℃冰箱中放置0d、2d、4d、8d進(jìn)樣測(cè)定，標(biāo)樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為2.87%，試樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為3.79%。結(jié)果表明標(biāo)樣與試樣中的秋水仙堿含量溫度穩(wěn)定性良好。

2.3 不同萱草屬植物中秋水仙堿含量比較

由表2可知，17份萱草屬植物花蕾中只有9種萱草屬植物中檢測(cè)出秋水仙堿，其余8種萱草屬植物花蕾中未檢測(cè)出秋水仙堿。萱草屬植物花蕾中秋水仙堿含量最高的是‘野生黃花1號(hào)’，為0.218μg/g，其次是‘北黃花’，為0.204μg/g?！秉S花’中秋水仙堿含量與‘東莊黃花’和‘沖里花1號(hào)’中秋水仙堿含量存在顯著差異，后兩者分別為0.187μg/g和0.184μg/g；這兩者又與‘金娃娃 1 號(hào)’、‘大荔黃花’、‘長(zhǎng)嘴子花 1 號(hào)’、‘茄子花1號(hào)’和‘茶子花’花蕾中秋水仙堿含量存在顯著差 異 ， 其 含 量 分 別 為 0.162μg/g、0.166μg/g、0.156μg/g、0.158μg/g和 0.164μg/g。而在其它 8 份材料中均未檢測(cè)出秋水仙堿。

2.4 秋水仙堿含量與花色的相關(guān)性分析

由表3可知，17份萱草屬植物材料中的秋水仙堿含量與花色的相關(guān)系數(shù)為-0.894，9種黃花材料的花蕾中均檢測(cè)到秋水仙堿，其余8種紅花材料的花蕾中均未檢測(cè)到秋水仙堿。

3 結(jié)論與討論

萱草屬植物花蕾中秋水仙堿HPLC檢測(cè)的最佳波長(zhǎng)為350nm。在17份材料中，‘野生黃花1號(hào)’、‘北黃花’、‘東莊黃花’、‘沖里花 1 號(hào)’、‘金娃娃 1 號(hào)’、‘大荔黃花’、‘長(zhǎng)嘴子花1號(hào)’、‘茄子花1號(hào)’和‘茶子花’等9份材料花蕾中檢測(cè)出秋水仙堿，而其它8份材料均未檢測(cè)出秋水仙堿。其中秋水仙堿含量最高的是‘野生黃花 1號(hào)’，為 0.218μg/g；其次是‘北黃花’，為0.204μg/g；含量最低的是‘長(zhǎng)嘴子花 1號(hào)’，為0.156μg/g。進(jìn)一步對(duì)花蕾中的秋水仙堿含量與花色進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明相關(guān)系數(shù)高達(dá)-0.894。

萱草屬植物中因含有秋水仙堿而被研究者關(guān)注，主要有兩方面的原因：一是研究秋水仙堿的藥理作用，二是為了探究萱草屬植物花蕾食用的安全性[11-13]。關(guān)于秋水仙堿的測(cè)定方法已有報(bào)道，有差示脈沖極普法[14]、伏安法[15]、熒光法[16]以及 HPLC[17-19]法，以 HPLC 居多。本研究通過(guò)3D掃描，在200～400nm內(nèi)檢測(cè)到兩處秋水仙堿最大吸收峰，其對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)分別為243nm和350nm。其中在243nm處檢測(cè)的秋水仙堿色譜峰的前面有小峰干擾，而350nm處的秋水仙堿色譜峰既沒(méi)有其他峰干擾，也無(wú)拖尾現(xiàn)象，這與劉桂花等[20]用HPLC法測(cè)定復(fù)方蘇潤(rùn)江滴丸中秋水仙堿和卞曉嵐等[17]利用高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方秋水仙堿膠囊中秋水仙堿含量時(shí)的波長(zhǎng)選擇的選定相一致，同時(shí)符合國(guó)標(biāo)法[21]中測(cè)定秋水仙堿的波長(zhǎng)選擇。

表2 供試樣品中秋水仙堿含量

表3 花色與秋水仙堿含量之間的相關(guān)系數(shù)

研究報(bào)道，臨床上，秋水仙堿中毒者多因過(guò)量攝入含有秋水仙堿的黃花菜，或者長(zhǎng)期服用含有秋水仙堿藥片所致[22]，短期血液中秋水仙堿量達(dá)0.5mg/kg，致死率上升[23]。在17份萱草屬植物花蕾中，有9種萱草屬植物中檢測(cè)出秋水仙堿，含量最低和最高的分別是‘長(zhǎng)嘴子花1號(hào)’和‘野生黃花1號(hào)’，分別為0.156μg/g和0.218μg/g，而在其它8種萱草屬植物花蕾中均未檢測(cè)出秋水仙堿，原因可能是因?yàn)檫@幾種萱草屬植物中秋水仙堿含量本身極低或不含秋水仙堿，尚需更精確的方法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。

本研究結(jié)果顯示，秋水仙堿含量與花色的相關(guān)系數(shù)為-0.894，其中‘潘龍花’為黃色花，未檢測(cè)出秋水仙堿，故在食用前不能單靠花色來(lái)區(qū)分鮮黃花菜是否含有秋水仙堿。

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