補(bǔ)喂亮氨酸對(duì)伊犁馬血漿氨基酸及其主要相關(guān)代謝物濃度的影響

艾畢肯， 賴(lài)曉鶴， 張文杰， 韓 明， 劉 律，張仕琦， 鄭文祥， 歐陽(yáng)文， 祁居中， 楊開(kāi)倫*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇縣種馬場(chǎng)，新疆昭蘇 835000）

亮氨酸（Leu），又稱(chēng)為白氨酸，是必需氨基酸之一，動(dòng)物機(jī)體自身不能合成，只能在日糧中獲?。↙ee等，2019）。Leu在肌肉中在支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的催化下能發(fā)生可逆反應(yīng)，生成α-酮異己酸（KIC），然后進(jìn)入肝臟，在肝臟細(xì)胞溶膠中被KIC二氧化酶催化生成β-羥基-β-甲基丁酸（HMB）（Arazi等，2018）。 Van 和 Nissen（1992）研究表明，Leu的代謝產(chǎn)物KIC和HMB同Leu一樣具有調(diào)控蛋白質(zhì)代謝的作用，抑制蛋白質(zhì)降解主要通過(guò)KIC刺激胰島素的分泌以及HMB抑制泛素-蛋白酶體系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行。

研究表明，食物缺乏的大鼠口服Leu可以刺激其骨骼肌蛋白質(zhì)的合成，這不依賴(lài)于循環(huán)中胰島素的濃度，而是通過(guò)促進(jìn)eIF4F的形成來(lái)進(jìn)行的（Anthony 等，2000）；Boutry 等（2013）的研究結(jié)果表明，給新生豬腸外輸注Leu能增加肌肉蛋白質(zhì)的合成；Suryawan 等（2012）為新生豬以 148 μmol/kg的輸注率從頸靜脈滴注Leu 10 min，然后再以400 μmol/kg·h持續(xù)滴注1 h，結(jié)果表明Leu通過(guò)誘導(dǎo)mTORC 1及其下游通路的激活來(lái)促進(jìn)新生豬mRNA的翻譯，使肌肉蛋白質(zhì)合成；Bro·jer等（2012）給馬匹服用葡萄糖和Leu時(shí)，馬匹運(yùn)動(dòng)后6 h內(nèi)的血漿胰島素濃度明顯高于給馬匹注射生理鹽水時(shí)的血漿胰島素濃度，但是，對(duì)馬匹體內(nèi)糖原合成速率沒(méi)有影響；而在人類(lèi)補(bǔ)充Leu的研究中，獨(dú)木舟運(yùn)動(dòng)員通過(guò)6周的飲食補(bǔ)充Leu，顯著提高了上半身力量和耐力（Crowe等，2006）。本試驗(yàn)選擇年齡為1歲的伊犁馬為研究對(duì)象，探究通過(guò)在日糧添加不同水平的Leu對(duì)伊犁馬血漿氨基酸濃度以及Leu及其代謝產(chǎn)物KIC、HMB吸收規(guī)律的影響，為L(zhǎng)eu在伊犁馬飼養(yǎng)中的應(yīng)用及Leu需要量的確定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn) 本試驗(yàn)于2019年9月18日至2019年10月8日在新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇縣種馬場(chǎng)進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧組成 試驗(yàn)采用單因素多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。挑選體重為（321.68±25.7）kg、年齡為1歲的伊犁馬20匹，分為四組，設(shè)為對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ組，每組5匹（3♀+2♂），試驗(yàn)馬匹日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，精料補(bǔ)充料及干牧草中氨基酸含量見(jiàn)表2。粗飼料每匹（7.00±0.80）kg/d，精料補(bǔ)充料 3 kg/d。 在此基礎(chǔ)上，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別補(bǔ)喂 17、34、51 g Leu（Leu購(gòu)自烏魯木齊市新華銳飼料有限公司，純度98%，含量≥90%）。玉米和次粉以1：1的比例混合均勻，再與Leu以1：1的比例制作成顆粒的形式與精料補(bǔ)充料混合飼喂。所有試驗(yàn)馬匹均在單獨(dú)的馬廄飼養(yǎng)，自由飲水。試驗(yàn)期21 d。每天定時(shí)打掃馬廄，更換干凈的墊料。

1.3 樣品的采集及指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 樣品的采集 在試驗(yàn)的第21天進(jìn)行樣品的采集。分別在飼喂前，飼喂后1、2、4 h用5 mL肝素鈉抗凝管于試驗(yàn)馬匹進(jìn)行頸靜脈采血。3500 r/min離心10 min，收集上清血漿，分裝于2 mL凍存管中，-20℃冷凍保存。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定 飼喂后2 h的血漿樣品指標(biāo)：20種氨基酸、3-甲基組氨酸（3-MH）；飼喂前、飼喂后 1、2、4 h 血漿樣品指標(biāo)：KIC、HMB。 以上樣品均送至天津普瑞華盛醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司測(cè)定。均采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行初步整理，再用SPSS 22.0軟件中單因素方差分析（one-way ANOVA）數(shù)據(jù)的差異顯著性，同時(shí)使用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。采用正交多項(xiàng)式對(duì)比，檢驗(yàn)日糧中Leu濃度增加的線(xiàn)性和二次效應(yīng)。以P＜0.05表示差異顯著水平，P＜0.01表示差異極顯著水平。

表1 精料補(bǔ)充料及干牧草的營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)） %

表2 精料補(bǔ)充料及干牧草中氨基酸含量（干物質(zhì)基礎(chǔ)）%

2 結(jié)果與分析

2.1 補(bǔ)喂Leu對(duì)伊犁馬血漿支鏈氨基酸濃度的影響 由圖1可知，血漿中Leu濃度隨著Leu補(bǔ)喂水平的增加而呈上升的趨勢(shì) （擬合方程為y=4.128x+102.84，R2=0.9492）。各試驗(yàn)組伊犁馬血漿Leu濃度均高于對(duì)照組。

圖1 日糧亮氨酸補(bǔ)喂水平與伊犁馬血漿亮氨酸濃度的關(guān)系

由表3可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅲ組血漿亮氨酸濃度顯著升高90.53%（P＜0.05）；試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ組血漿異亮氨酸濃度分別降 低 32.18% （P ＜ 0.05）、50.53% （P ＜ 0.01）、39.27%（P＜0.05）；試驗(yàn)Ⅱ組血漿纈氨酸濃度有下降趨勢(shì)（P=0.044）。

表3 補(bǔ)喂亮氨酸對(duì)伊犁馬血漿支鏈氨基酸濃度的影響 μmol/L

2.2 補(bǔ)喂Leu對(duì)伊犁馬血漿KIC、HMB濃度的影響

2.2.1 補(bǔ)喂Leu對(duì)伊犁馬血漿KIC濃度的影響由圖2可知，血漿KIC隨著Leu補(bǔ)喂水平的增加而呈上升的趨勢(shì)。不補(bǔ)喂Leu時(shí)，血漿KIC濃度最低，Leu補(bǔ)喂水平為每匹馬每頓8.5～17 g時(shí)血漿KIC濃度趨于平緩，超過(guò)17 g時(shí)，血漿KIC濃度有持續(xù)升高的趨勢(shì)。

圖2 日糧亮氨酸補(bǔ)喂水平與伊犁馬血漿中α-酮異己酸濃度的關(guān)系

由表4可知，在飼喂前，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組血漿KIC濃度差異不顯著 （P＞0.05），試驗(yàn)Ⅲ組血漿KIC濃度顯著升高 （P＜0.05），升高了30.56%。與試驗(yàn)Ⅱ組相比，試驗(yàn)Ⅲ組血漿KIC濃度顯著升高 （P＜0.05），升高了35.52%。飼喂后1 h各組血漿KIC濃度差異不顯著（P＞0.05）。在飼喂后2 h，試驗(yàn)Ⅲ組血漿KIC濃度比對(duì)照組顯著升高 （P＜0.05），升高了43.54%。在飼喂后4 h，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組血漿KIC濃度差異不顯著 （P＞0.05），試驗(yàn)Ⅲ組血漿KIC濃度極顯著升高 （P＜0.01），升高了53.91%。

表4 補(bǔ)喂亮氨酸對(duì)伊犁馬血漿α-酮異己酸濃度的影響μmol/L

2.2.2 補(bǔ)喂Leu對(duì)伊犁馬血漿HMB濃度的影響由圖3可知，不補(bǔ)喂Leu時(shí)伊犁馬血漿HMB濃度最高，其隨著Leu補(bǔ)喂水平的增加而呈下降的趨勢(shì)，當(dāng)每匹馬每頓Leu補(bǔ)喂水平＞17 g時(shí)，血漿HMB濃度趨于平緩。

圖3 日糧亮氨酸補(bǔ)喂水平與伊犁馬血漿中β-羥基-β-甲基丁酸濃度的關(guān)系

由表5可知，補(bǔ)喂Leu對(duì)伊犁馬血漿HMB濃度無(wú)顯著影響（P＞0.05）。對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組血漿HMB濃度在飼喂后1 h達(dá)到峰值，試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ組血漿HMB濃度在飼喂后4 h達(dá)到峰值。

表5 補(bǔ)喂亮氨酸對(duì)伊犁馬血漿β-羥基-β-甲基丁酸濃度的影響 μmol/L

2.3 補(bǔ)喂Leu對(duì)血漿中非支鏈氨基酸、3-甲基組氨酸濃度的影響 由表6可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組血漿Glu濃度極顯著降低37.07%（P＜0.01），試驗(yàn)Ⅲ組顯著降低 26.52%（P ＜ 0.05）。

與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅲ組血漿3-MH濃度有下降趨勢(shì)（P=0.055），血漿半胱氨酸濃度有下降的趨勢(shì)（P=0.060）。與試驗(yàn)Ⅰ組相比，試驗(yàn)Ⅲ組血漿3-MH濃度有下降趨勢(shì)（P=0.051）。

表6 補(bǔ)喂亮氨酸對(duì)伊犁馬血漿非支鏈氨基酸濃度的影響 μmol/L

3 討論

3.1 補(bǔ)喂Leu對(duì)伊犁馬血漿氨基酸濃度的影響B(tài)CAA能促進(jìn)腸道發(fā)育，促進(jìn)腸道氨基酸運(yùn)輸和黏液蛋白的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，刺激骨骼肌蛋白合成，研究表明，BCAA中最有效的是Leu（Escobar等，2010）。Leu具有刺激骨骼肌中蛋白質(zhì)合成和抑制蛋白質(zhì)降解的能力，這種促進(jìn)蛋白質(zhì)合成主要通過(guò)上調(diào)雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1）的活性，而抑制降解主要在組織中通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑發(fā)生 （Norton和Layman，2006）。

本試驗(yàn)中，補(bǔ)喂Leu顯著提高了伊犁馬血漿Leu濃度，極顯著降低血漿Ile濃度，血漿Val濃度有下降的趨勢(shì)，對(duì)BCAA濃度無(wú)顯著影響。孫玉麗（2015）為7日齡的正常新生哺乳仔豬及宮內(nèi)生長(zhǎng)受限新生哺乳仔豬連續(xù)灌服14 d的Leu，研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，給正常新生仔豬補(bǔ)喂Leu極顯著提高了血漿中Leu濃度，極顯著降低了血漿中Val和Ile的濃度，為宮內(nèi)生長(zhǎng)受限新生哺乳仔豬補(bǔ)喂Leu極顯著升高了血漿中Leu濃度，血漿中Val及Ile濃度隨著補(bǔ)喂的Leu水平升高有下降的趨勢(shì)；Wiltafsky等（2010）為去勢(shì)豬補(bǔ)喂Leu 34 d，共6個(gè)處理組，L100組Leu水平為11.5 g 標(biāo)準(zhǔn)化回腸可消化 Leu/kg，L150、L175、L200組的Leu水平為 L100組的 150%、175%、200%，在大于200%的組中，Leu水平為L(zhǎng)100組的一倍，該研究的陽(yáng)性對(duì)照組日糧組成與L100組相同，但I(xiàn)le水平為6.3 g標(biāo)準(zhǔn)化回腸可消化Ile/kg，研究結(jié)果表明補(bǔ)喂Leu增加一倍的組，血漿Leu增加64%，這與本研究結(jié)果一致。這是因?yàn)長(zhǎng)eu與其他BCAA競(jìng)爭(zhēng)抑制。BCAA家族及Trp是由中性氨基酸轉(zhuǎn)移載體 （LAT）家族中的一員LAT1轉(zhuǎn)運(yùn)的，這是因?yàn)楹兄ф満捅江h(huán)側(cè)鏈大分子的BCAA與其親和力較強(qiáng) （Neinast等，2019）。Leu競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合LAT1，抑制了Ile及Val在血漿 中 的 量 （Wolfe 和 Robert，2017；Louard 等 ，1990）。Leu血漿濃度的升高激活了所有BCAA的氧化代謝途徑，結(jié)果導(dǎo)致血漿中Ile和Val降低，當(dāng)單獨(dú)使用Leu時(shí)，Ile和Val的可用性可能會(huì)限制肌肉蛋白質(zhì)合成的速度（董千銅等，2014）。Zeitz等（2019）將450只成年雄性肉雞平均分為三個(gè)試驗(yàn)組，對(duì)照組飼喂超過(guò)推薦劑量15%的Leu，L35組飼喂超過(guò)推薦劑量35%的Leu，L60組飼喂超過(guò)推薦水平60%的Leu，進(jìn)行為期5周的試驗(yàn)，結(jié)果顯示L60組的Leu既不會(huì)影響肉雞蛋白質(zhì)合成和降解的分子途徑，也不會(huì)影響5周內(nèi)的生產(chǎn)性能。隨著Leu攝入量增加到所需水平，Ile和Val的濃度下降，可能是由于這些氨基酸現(xiàn)在正以越來(lái)越多的量用于蛋白質(zhì)合成。然而，Val、Leu、Ile的比例幾乎總是接近于1.6：2.2：1.0（Louard等，1990），這也可能是在本研究中Ile濃度低的原因。

本試驗(yàn)中，試驗(yàn)Ⅰ組血漿谷氨酸的濃度極顯著低于對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅲ組顯著低于對(duì)照組。當(dāng)動(dòng)物體內(nèi)氨基酸降解速度過(guò)高，體內(nèi)產(chǎn)生一些過(guò)量且必須排出的氨時(shí)，氨基酸降解速度增高的信號(hào)會(huì)使轉(zhuǎn)氨反應(yīng)加速，從而會(huì)引起谷氨酸濃度的增高（Schachter和 David，2008）。 而本試驗(yàn)中血漿谷氨酸濃度降低，可能是由于馬匹血漿氨基酸降解的速度下降引起氨的量降低，導(dǎo)致谷氨酸濃度降低。

在谷氨酰胺合成酶的催化下，谷氨酸轉(zhuǎn)化成谷氨酰胺，動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)多氨與谷氨酸結(jié)合，生成谷氨酰胺（Erich，2008），而本試驗(yàn)中血漿谷氨酰胺的濃度差異不顯著，可能是由于該反應(yīng)是可逆的，處于動(dòng)態(tài)平衡中。

3-MH可用于識(shí)別蛋白質(zhì)的代謝。3-MH濃度的輸出用作肌肉蛋白質(zhì)降解程度的指標(biāo)，3-MH在肌肉降解期間釋放到循環(huán)中，然后在尿中定量、不可逆地排出而不被代謝（David和Pearlstone，1996）。肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白分解過(guò)程中的組氨酸甲基化是3-MH的唯一來(lái)源（Nagasawa和Takashi，1996）。馬匹是草食動(dòng)物，體內(nèi)的3-MH來(lái)源于飼糧中攝入的蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)攝入對(duì)肌肉代謝的影響，導(dǎo)致3-MH不同程度的釋放到血液中（Kochlik等，2018）。也有研究表明，馬匹血漿中的3-MH濃度會(huì)受到季節(jié)的影響，主要是熱應(yīng)激引起的，在7～9月馬匹血漿中3-MH的濃度顯著增加，在此之后降低（Glade等，1990）。本試驗(yàn)中試驗(yàn)Ⅲ組3-MH濃度有下降的趨勢(shì)，隨著Leu補(bǔ)喂水平的升高，3-MH的排出下降，這可能是補(bǔ)喂Leu有抑制蛋白質(zhì)降解的作用，還需要進(jìn)一步研究。

3.2 補(bǔ)喂Leu對(duì)伊犁馬血漿KIC、HMB濃度的影響 Leu促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的作用，可能是通過(guò)其代謝產(chǎn)物KIC和HMB的作用產(chǎn)生的（Wilkinson等，2013），然而，支持這種觀(guān)點(diǎn)的證據(jù)鮮有報(bào)道。KIC作為L(zhǎng)eu的直接代謝產(chǎn)物，且在分解代謝過(guò)程中刺激蛋白質(zhì)合成的能力已被研究了60多年（Kang 等，1986），研究表明，KIC 能夠在不增加細(xì)胞內(nèi)Leu濃度的情況下促進(jìn)大鼠心肌中蛋白質(zhì)合成并抑制蛋白質(zhì)降解（Tischler等，1982）。HMB不僅能夠提高肌肉功能，而且能夠提高脂肪代謝速率并降低蛋白質(zhì)分解速率，促進(jìn)組織細(xì)胞修復(fù)，減輕肌肉損傷并延緩肌肉疲勞（He等，2016；Korna-sio 等，2009）。

本試驗(yàn)中，血漿KIC的濃度隨著Leu的補(bǔ)喂水平呈升高趨勢(shì)，在飼喂前，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅲ組血漿KIC濃度顯著升高。飼喂后1 h各組血漿KIC濃度差異不顯著，各組都達(dá)到峰值，在飼喂后2 h各組血漿KIC濃度開(kāi)始下降，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅲ組血漿KIC濃度顯著升高，飼喂后4 h，試驗(yàn)Ⅲ組血漿KIC濃度極顯著升高；Wiltafsky等（2010）研究表明，為豬補(bǔ)喂不同水平的Leu，比Leu水平為11.5 g標(biāo)準(zhǔn)化回腸可消化Leu/kg多一倍的Leu組，在試驗(yàn)第34天試驗(yàn)動(dòng)物禁食2.5 h后血漿中的KIC濃度增加了45%。這與本研究結(jié)果一致。在本試驗(yàn)中，在飼喂后2 h，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅲ組血漿中KIC濃度升高43.54%，在飼喂后4 h血漿中KIC的濃度升高了53.91%，這說(shuō)明補(bǔ)喂Leu伊犁馬血漿中的KIC濃度呈劑量依賴(lài)性增加。補(bǔ)喂Leu對(duì)伊犁馬血漿HMB濃度差異不顯著。飼糧中攝入的Leu可以繞過(guò)肝臟，使補(bǔ)喂后血漿Leu水平急劇升高，并在周?chē)M織中激活Leu信號(hào)傳導(dǎo)，隨后Leu在肌肉中被支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的催化下發(fā)生可逆反應(yīng)，生成KIC，然后KIC可以重新合成為L(zhǎng)eu或被進(jìn)一步氧化（Duan 等 ，2016；Shimomura 等 ，2001）。 大 多 數(shù)KIC氧化發(fā)生在肝臟中肝線(xiàn)粒體內(nèi)，約90%的KIC被氧化為乙酰輔酶A的類(lèi)似物異戊酰CoA，剩余5%～10%的KIC在肝臟細(xì)胞溶膠中被氧化為HMB，其中10%～40%隨尿液排出，其余的轉(zhuǎn)化為膽固醇和乙酰輔酶A（Arazi等，2018）。隨后，僅由Leu產(chǎn)生的HMB被腎臟清除或代謝為β-羥基 -β - 甲 基 戊 二 酰 -CoA （Girón 等 ，2016）。Wilkinson等 （2013） 研究表明， 向年齡為 （21±0.3），體重相近的7名健康男性青年受試者提供含有3.42 g Leu的400 mL水，采集2.5 h內(nèi)的血液樣品，結(jié)果表明血漿中的HMB濃度一直保持不變，直到 150 min 后，HMB 濃度才從（3.2±0.6）μ mol適度上升到（10.3±3.5）μmol。 而在本研究中，補(bǔ)喂Leu對(duì)伊犁馬血漿HMB濃度無(wú)顯著影響，這可能是由于物種的不同和補(bǔ)喂Leu水平的不同引起的Leu代謝差異，也有可能是不同物種機(jī)體內(nèi)Leu代謝途徑中相關(guān)酶的活性表達(dá)不同。

KIC的半衰期極短，血液中KIC的代謝很快（Harper和 Benjamin，1984）， 可能是因?yàn)?KIC 的氧化速率很快，這就解釋了各組血漿中KIC的濃度在飼喂后1 h達(dá)到峰值，然后下降的原因。但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)Ⅲ組血漿KIC的濃度趨于平緩，可能是由于補(bǔ)喂的Leu水平足夠，在KIC氧化的同時(shí)，Leu也在不斷地轉(zhuǎn)化為KIC（Moghei等，2016）。在Leu代謝的路徑中由于只有極少的Leu才能轉(zhuǎn)化為HMB，所以機(jī)體的HMB濃度也極少（Silva等，2017），這可能是本研究中補(bǔ)喂Leu對(duì)伊犁馬血漿HMB濃度的影響不顯著的原因。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，補(bǔ)喂亮氨酸能提高伊犁馬血漿中亮氨酸的濃度，且隨著補(bǔ)喂水平的增加而升高；補(bǔ)喂亮氨酸降低了血漿異亮氨酸濃度，血漿3-甲基組氨酸濃度有下降的趨勢(shì)。補(bǔ)喂亮氨酸能提高伊犁馬血漿中α-酮異己酸濃度，但對(duì)血漿β-羥基-β-甲基丁酸的濃度無(wú)顯著影響。