利用熒光蛋白示蹤腦微血管內(nèi)皮細胞微絲的動態(tài)變化

杜書嵩，趙偉東

（中國醫(yī)科大學(xué)1.生命科學(xué)學(xué)院發(fā)育細胞生物學(xué)教研室，教育部醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)重點實驗室暨衛(wèi)健委細胞生物學(xué)重點實驗室，沈陽 110122；2.附屬第一醫(yī)院肛腸外科，沈陽 110001）

肌動蛋白是真核生物細胞骨架微絲的主要組成成分，肌動蛋白單體形式稱為球狀肌動蛋白，能夠聚合成肌動蛋白絲，進而組裝形成微絲。肌動蛋白參與多種細胞的生命活動，包括維持細胞形狀、細胞運動、細胞分裂、吞噬和細胞內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)龋?］。為了對細胞中的肌動蛋白進行觀察，目前研究人員常用能夠與肌動蛋白絲結(jié)合的熒光標記的鬼筆環(huán)肽對固定后的細胞進行染色［2］，這樣能夠在熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)肌動蛋白絲的分布和變化。有研究［3］報道，細胞在固定過程中其肌動蛋白結(jié)構(gòu)會受到一定程度的破壞，因此鬼筆環(huán)肽染色方法不一定能準確顯示肌動蛋白絲的變化。因此，很多學(xué)者嘗試利用活細胞模型對肌動蛋白進行研究。為了在活細胞中分析肌動蛋白絲的動態(tài)變化，有學(xué)者通過向細胞內(nèi)注射微量熒光標記的鬼筆環(huán)肽對細胞中的肌動蛋白絲進行標記，也有學(xué)者將編碼肌動蛋白和綠色熒光蛋白 （green fluorescent protein，GFP） 融合基因的載體轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)，以實現(xiàn)在活細胞中對肌動蛋白的動態(tài)變化進行檢測，然而上述方法對活細胞中肌動蛋白的動力學(xué)也有一定影響［4］。因此，目前亟需既能對活細胞中的肌動蛋白進行實時觀察，又不影響肌動蛋白功能的方法。

腦微血管內(nèi)皮細胞 （brain microvascular endothelial cell，BMEC） 是組成腦微血管的細胞，也是構(gòu)成血腦屏障的重要細胞組分。BMEC間存在緊密連接以及黏附連接結(jié)構(gòu)，而肌動蛋白與緊密連接以及黏附連接均有關(guān)聯(lián)。肌動蛋白與ZO蛋白家族 （包括ZO-1、ZO-2、ZO-3） 直接結(jié)合，并與緊密連接蛋白閉鎖蛋白和閉合蛋白一起維護緊密連接結(jié)構(gòu)，而且肌動蛋白還與連環(huán)蛋白結(jié)合，參與黏附連接的形成［5］。有研究報道，細胞松弛素處理或缺血缺氧條件下都會導(dǎo)致BMEC肌動蛋白絲解聚，通過破壞BMEC間的連接結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致血腦屏障滲漏［6］。另外，在生理和病理條件下的腦微血管新生過程中，位于新生血管芽末端的BMEC （也稱尖端細胞） 會形成由肌動蛋白組成的放射狀絲狀偽足，用于引導(dǎo)新生血管出芽的方向［7］。因此，肌動蛋白在維護BMEC結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮重要作用。

Lifeact是從酵母菌中分離的由17個氨基酸組成的短肽，具有穩(wěn)定結(jié)合肌動蛋白絲的特性［8］。本研究構(gòu)建了GFP標記的Lifeact真核表達載體 （LifeactpEGFP），將其轉(zhuǎn)染至BMEC中，用于在活細胞中觀察肌動蛋白的動態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lifeact-pEGFP可以有效地標記BMEC中的肌動蛋白絲，并能反映肌動蛋白的動態(tài)變化，且對細胞的存活沒有明顯影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人BMEC為美國約翰·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院KIM博士惠贈。

1.1.2 主要試劑：青霉素-鏈霉素雙抗購自美國Hyclone公司；RPMI 1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶購自美國Gibco公司；Nu血清購自美國BD Biosciences公司；Lipofectamine 2000和鬼筆環(huán)肽購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8檢測試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定：以pEGFP-N1為載體，選擇多克隆位點中的XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點，以無縫克隆方法，把Lifeact的編碼序列克隆至pEGFP-N1載體中；然后提取重組質(zhì)粒，以限制性內(nèi)切酶BamHⅠ進行酶切反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠電泳成像系統(tǒng)對酶切結(jié)果進行分析。

1.2.2 細胞培養(yǎng)：BMEC培養(yǎng)于含10%胎牛血清、10%Nu血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2、100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換新鮮培養(yǎng)液。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染：將BMEC以1×106/孔接種于6孔板，待細胞密度達到70%～80%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 h更換RPMI 1640培養(yǎng)基，將Lipofectamine 2000與Lifeact-pEGFP質(zhì)?；騪EGFP-N1載體質(zhì)粒按一定比例混合后轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染5 h后，更換為含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 細胞增殖實驗：將BMEC分為2組，分別轉(zhuǎn)染Lifeact-pEGFP質(zhì)粒和pEGFP-N1空載體質(zhì)粒，消化并接種在96孔板中，2×103/孔，體積為100 μL，每組設(shè)3個復(fù)孔。分別在24、48、72和96 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱孵育1 h，隨后采用酶標儀檢測450 nm處吸光度值。

1.2.5 免疫熒光染色：將BMEC分為2組，分別轉(zhuǎn)染Lifeact-pEGFP質(zhì)粒和pEGFP-N1空載體，24 h后 用PBS洗3次，隨后用4%甲醛于室溫固定30 min。固定后的細胞用PBS洗3次，每次5 min。加入0.1% Triton X-100處理5 min，細胞用PBS洗3次，用5%牛血清白蛋白于室溫封閉30 min。加入1 ∶1 000稀釋的羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽，避光孵育1 h。PBS洗3次，用封片劑封片，以共聚焦激光掃描顯微鏡 （型號Ti2，日本Nikon公司） 觀察并采集圖像。

1.2.6 細胞伸展實驗：為了實時評估細胞黏附伸展情況，將轉(zhuǎn)染的BMEC消化后接種于玻璃底面的共聚焦專用直徑35 mm細胞培養(yǎng)皿中，并將其置于安裝在顯微鏡載物臺上的37 ℃培養(yǎng)小室中，每30 s成像1次，以倒置共聚焦激光掃描顯微鏡成像60 min。成像過程中以細胞初始位置為中心，觀察細胞向外周的伸展情況。

1.2.7 細胞劃痕實驗：將BMEC接種于玻璃底細胞培養(yǎng)皿中，于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后24 h，用無菌吸頭在長滿細胞的培養(yǎng)皿上均勻地劃一道直線。用PBS洗細胞3次，加入無血清培養(yǎng)基，置于安裝在顯微鏡載物臺上的37 ℃培養(yǎng)小室中，設(shè)定拍攝間隔60 s，累計成像60 min。共聚焦顯微鏡成像過程中以細胞初始位置為中心，觀察細胞向劃痕方向的遷移情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗至少重復(fù)3次，使用GraphPad Prism 6軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。2組比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lifeact-pEGFP質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

利用pEGFP-N1載體的多克隆位點中的XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點，把Lifeact的編碼序列 （54 bp）克隆至載體中，獲得重組質(zhì)粒Lifeact-pEGFP （4 754 bp） 后，將質(zhì)粒DNA以BamHⅠ進行酶切，采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，利用紫外凝膠電泳成像系統(tǒng)拍照記錄，在5 000 bp處可見清晰DNA條帶 （圖1A）。將Lifeact-pEGFP質(zhì)粒進行DNA測序分析，發(fā)現(xiàn)插入序列與酵母的Lifeact的序列一致 （圖1B），說明Lifeact-pEGFP重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 Lifeact-pEGFP質(zhì)粒的鑒定Fig.1 Identification of the recombinant Lifeact-pEGFP construct

2.2 Lifeact-pEGFP的表達不影響B(tài)MEC的存活

為了探討Lifeact-pEGFP重組質(zhì)粒的表達是否對BMEC存活產(chǎn)生影響，在BMEC轉(zhuǎn)染Lifeact-pEGFP質(zhì)粒和pEGFP-N1空載體質(zhì)粒后24、48、72、96 h，利用CCK-8試劑進行檢測，判斷活細胞的數(shù)量。與轉(zhuǎn)染pEGFP-N1載體質(zhì)粒的BMEC相比，轉(zhuǎn)染LifeactpEGFP后的BMEC在各個時間點的存活水平?jīng)]有明顯變化，無統(tǒng)計學(xué)差異 （P> 0.05），見圖2。說明LifeactpEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BMEC后，表達產(chǎn)生的LifeactpEGFP融合蛋白對細胞的存活沒有明顯影響，可以進行后續(xù)實驗研究。

2.3 BMEC中表達的Lifeact-pEGFP與肌動蛋白絲呈共定位

圖2 Lifeact-pEGFP質(zhì)粒表達對BMEC存活的影響Fig.2 Survival of BMECs transfected with Lifeact-pEGFP

為了分析在BMEC中表達的Lifeact-pEGFP與肌動蛋白的相關(guān)性，分別將轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體質(zhì)粒和Lifeact-pEGFP質(zhì)粒的BMEC固定后以紅色熒光標記的鬼筆環(huán)肽進行染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lifeact-pEGFP的綠色熒光信號與鬼筆環(huán)肽的紅色熒光信號位置分布一致，而pEGFP-N1空載體無上述分布特點 （圖3A、3C）。進一步對圖3A和3C中白色虛線位置進行雙通道熒光譜線分析，結(jié)果顯示，pEGFP-N1空載體質(zhì)粒與鬼筆環(huán)肽信號無共定位，Lifeact-pEGFP與鬼筆環(huán)肽的熒光信號呈明顯共定位 （圖3B、3D）。以上結(jié)果顯示，Lifeact-pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMEC后表達的Lifeact-pEGFP融合蛋白能夠顯示BMEC中的肌動蛋白絲，主要表現(xiàn)為分布于胞質(zhì)內(nèi)的應(yīng)力纖維，以及分布于細胞邊緣的皮質(zhì)纖維，而細胞核區(qū)域的肌動蛋白絲則很少，這與鬼筆環(huán)肽染色標記的肌動蛋白絲一致，即利用Lifeact-pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法可以對BMEC中的肌動蛋白絲進行標記。

圖3 BMEC中表達的Lifeact-pEGFP能夠標記肌動蛋白絲Fig.3 Localization of F-actin in BMECs by the expression of Lifeact-pEGFP

2.4 Lifeact-pEGFP的表達可以顯示BMEC在伸展過程中肌動蛋白絲的動態(tài)變化

為了分析Lifeact-pEGFP是否可以用來檢測肌動蛋白的動態(tài)變化，將轉(zhuǎn)染Lifeact-pEGFP質(zhì)粒的BMEC消化后重新接種于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，此時可以觀察到細胞從懸浮至貼壁的整個過程，即細胞伸展，同時利用激光共聚焦顯微鏡對活細胞和GFP熒光信號進行連續(xù)觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在細胞逐漸伸展的過程中，肌動蛋白絲主要分布于細胞邊緣，對熒光信號的分布進行分析發(fā)現(xiàn)，Lifeact-pEGFP主要分布于細胞外周皮質(zhì)區(qū) （圖4A、4B）。BMEC伸展時，在細胞外周皮質(zhì)區(qū)形成片狀偽足和絲狀偽足的結(jié)構(gòu)，且片狀偽足和絲狀偽足內(nèi)的Lifeact-pEGFP標記的肌動蛋白絲并不是恒定不變，而是呈現(xiàn)出高度動態(tài)的變化 （圖4A）。在細胞伸展早期，肌動蛋白絲均勻分布于細胞皮質(zhì)區(qū)并參與形成較多絲狀偽足；在細胞伸展的晚期，隨著細胞面積逐漸增大，肌動蛋白絲的分布出現(xiàn)極性分布，細胞形態(tài)也由圓形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯刃位蛩笮?。細胞面積的測量結(jié)果顯示，隨著時間的進展，BMEC的面積逐漸增大，在60 min內(nèi)呈線性增長趨勢 （圖4C）。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Lifeact-pEGFP可以用來分析細胞伸展時肌動蛋白絲的動態(tài)變化。

2.5 Lifeact-pEGFP能夠標記運動細胞前導(dǎo)緣肌動蛋白絲的動態(tài)變化

為了分析Lifeact-pEGFP是否可以用來檢測細胞遷移時肌動蛋白的動態(tài)變化，將轉(zhuǎn)染LifeactpEGFP質(zhì)粒的BMEC消化后重新接種于玻璃底培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞接近長滿時進行劃痕實驗。然后在37 ℃的培養(yǎng)小室中以激光共聚焦顯微鏡對活細胞和GFP的熒光信號進行連續(xù)觀察，主要關(guān)注向劃痕區(qū)域逐漸移動的單個細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在BMEC逐漸向劃痕區(qū)遷移的過程中，Lifeact-pEGFP顯示的肌動蛋白絲主要分布于細胞的前導(dǎo)緣 （即朝向劃痕方向的細胞邊緣），且構(gòu)成前導(dǎo)緣的片狀偽足內(nèi)的肌動蛋白絲呈高度動態(tài)的變化 （圖5A、5B）。以上結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Lifeact-pEGFP可以用來分析BMEC遷移時前導(dǎo)緣肌動蛋白絲的動態(tài)變化。

3 討論

圖4 BMEC在貼壁伸展過程中Lifeact-pEGFP標記的肌動蛋白絲的變化Fig.4 Changes of Lifeact-pEGFP labeled F-actin in BMECs during cell spreading

圖5 轉(zhuǎn)染Lifeact-pEGFP后可以標記細胞遷移過程中BMEC肌動蛋白絲的變化Fig.5 F-actin dynamics in migrating BMECs indicated by the expression of Lifeact-pEGFP

Lifeact是在酵母菌中發(fā)現(xiàn)的一種含有17個氨基酸的短肽，具有穩(wěn)定結(jié)合肌動蛋白絲的特性［8-9］。本研究構(gòu)建了GFP標記Lifeact的真核表達載體即Lifeact-pEGFP，并成功將Lifeact-pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人BMEC中。細胞存活實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染LifeactpEGFP后BMEC存活未受到影響，因此在細胞轉(zhuǎn)染Lifeact-pEGFP質(zhì)粒后，可以在活細胞水平進行長時間實時檢測，從而可以觀察細胞伸展和遷移過程中肌動蛋白絲的動態(tài)變化，在BMEC活細胞中實現(xiàn)對肌動蛋白絲的可視化研究，為研究血管內(nèi)皮細胞中肌動蛋白絲的動態(tài)變化提供了直觀高效的手段。

肌動蛋白絲在BMEC中主要呈現(xiàn)為橫貫細胞的聚集而成的應(yīng)力纖維，以及沿著細胞邊緣聚集形成的皮質(zhì)纖維。在Lifeact-pEGFP轉(zhuǎn)染的BMEC中，細胞中的GFP熒光信號能夠反映應(yīng)力纖維和皮質(zhì)纖維的分布，且與鬼筆環(huán)肽染色的信號能夠?qū)崿F(xiàn)明顯的共定位，這說明Lifeact-pEGFP融合蛋白能夠與肌動蛋白絲直接結(jié)合，從而能夠反映肌動蛋白絲分布的部位。而且，Lifeact-pEGFP熒光信號的強弱還能用來判斷肌動蛋白的聚合程度，即在有較多肌動蛋白分子聚集的部位，其能夠結(jié)合的Lifeact-pEGFP也較多，因此熒光信號也較強；反之則較弱。

細胞在遷移過程中形態(tài)出現(xiàn)明顯變化，朝向細胞遷移方向的細胞邊緣稱為前導(dǎo)緣，是決定細胞遷移的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)［10］。本研究顯示，Lifeact-pEGFP在正常培養(yǎng)的BMEC中主要以應(yīng)力纖維和皮質(zhì)纖維的形式呈現(xiàn)，在細胞中央和細胞周邊均有分布；然而，在遷移的BME中，Lifeact-pEGFP主要分布于前導(dǎo)緣，說明細胞遷移過程中肌動蛋白單體發(fā)生了重新分布，形成應(yīng)力纖維和皮質(zhì)纖維的肌動蛋白絲發(fā)生了解聚，解聚后的肌動蛋白單體則在前導(dǎo)緣重新組裝。研究［11-12］顯示，導(dǎo)致肌動蛋白組裝的上游因子主要是Wiskott-Aldrich綜合征蛋白和Wiskott-Aldrich Verprolin蛋白被激活后引起的肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合體的活化，從而使新的肌動蛋白絲在與原有肌動蛋白絲呈70°的方向延長，推動前導(dǎo)緣向前移動。

需要指出的是，也有研究［13］報道過表達Lifeact-GFP能夠使coffilin與肌動蛋白的結(jié)合增多，從而對肌動蛋白絲的組裝有一定的抑制效應(yīng)。因此，筆者建議在實際進行Lifeact-pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的實驗時，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的劑量不應(yīng)過多。