核轉位在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的研究進展

周 杰，黃英輝

(陸軍軍醫(yī)大學 1.西南醫(yī)院 腫瘤科； 2.預防醫(yī)學院 復合傷研究所， 重慶 400038)

腫瘤是嚴重危害人類健康的重大疾病[1]。中國腫瘤病死率自2006年以來有所降低，但是仍然是中國居民重要的死亡原因，也是最主要的公共健康問題，全球腫瘤發(fā)病率和病死率也依然在快速增長[1]。因此，對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展，依然是值得廣大研究者不斷去深入探索的一個主題。

腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的過程，這個過程中包括了抑癌基因的失活、癌基因的異常激活、蛋白表達的空間時間發(fā)生紊亂等，而胞核-胞質(nuclear-cytoplasmic translocation，簡稱“核轉位”)轉位則在上述過程中扮演了重要的角色，最終導致腫瘤惡性程度高、治療效果差。因此，核轉位近年來也愈發(fā)受到廣大研究者的關注，如：對核轉位進行調控可治療難治性肺癌；代謝調節(jié)酶PFKFB3的核轉位異常可促進糖酵解[2]等。因此，本文對核轉位通路的基本結構、生物學功能及其調控機制進行綜述，旨在

探索通過調控功能蛋白的核轉位而抑制腫瘤，將從一個新的角度探究腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制及其干預措施。

1 核轉位通路的基本結構

真核細胞的細胞質、細胞核被細胞核膜分隔開。細胞核內的功能蛋白在胞質中合成，經過唯一的通道——核孔復合體(nuclear pore complex，NPC)進入胞核，在細胞增殖、分化、凋亡和基因表達調控等過程中發(fā)揮了重要作用[3]。小分子物質可通過主動擴散在胞核胞質之間移位，而大分子蛋白、復合物等則需要借助于核轉位受體介導的主動運輸。

1.1 核孔復合體

NPC又稱為核孔蛋白，為具有“分子篩”功能的孔狀結構，鑲嵌于核膜，故命名為“核孔”。 NPC形狀類似于籃球網狀結構，內外各有8個球狀顆粒，核孔中央有一個中心顆粒，中心顆粒的細絲與16個球狀顆粒相互連接。NPC分子質量為125 ku，由30余種高度保守的蛋白構成，它能提供靶蛋白與核轉位受體的結合位點，使其通過NPC入核[4]。

1.2 核轉位信號

核轉位信號主要包括入核信號(nuclear localization signal，NLS)和出核信號(nuclear export signal，NES)。二者均為富含堿性氨基酸的肽段，一般不超過8～10個氨基酸。NLS通常分為兩類：4～7個氨基酸構成的短基本序列，以及由兩個延伸的基本氨基酸序列組成的較長的二部分序列，該序列由5～20個保守性較低的氨基酸隔開[5]。NES則大致符合以下序列Φ-X2-3-Φ-X2-3-Φ-X-Φ(Φ=L,I,V,F,M; X為任意氨基酸)[6]。靶蛋白需要具備核轉位信號才能被核轉運受體識別，而攜帶核轉位信號并非一定就會發(fā)生核轉位。核轉運信號被覆蓋或者被修飾均會導致核轉位失敗[2,7]。

1.3 核轉運受體

核轉運受體Karyopherin是一種受體蛋白，與選擇性轉運密切相關。Karyopherin家族包括Karyopherin α和Karyopherin β[8]。Karyopherin β(Kapβ，importin/exportin)亞家族包含超過20個成員，發(fā)揮入核或出核轉運的功能。Karyopherin β1(Kpnβ1)，又叫Importinβ，是主要的入核轉運受體。而Karyopherin β亞家族中：CAS、染色質區(qū)域維持因子1(chromosomal region maintenance 1，CRM1)、exportin-t、MSN5是目前已證明的參與出核的4種轉運蛋白。Karyopherin α(Kpn α)，又叫Importin α，是NLS的受體蛋白，其C端為NLS結合域，N端為Karyopherin β1結合域。Importin α與Importin β結合后形成Importin α/β異源二聚體，再識別貨物蛋白的NLS形成三聚體[8]。該三聚體通過NPC入核，從而完成經典的核轉位過程。

2 核轉位通路介導的出入核機制

2.1 漿蛋白入核

胞質-胞核轉運通路(圖1)。經典的核輸入過程：Karyopherin α/β1異源二聚體形成后，Karyopherin α識別含有NLS序列的貨物蛋白形成三聚體。該三聚體通過Karyopherin β1結合到NPC的胞質面并與Ran-GDP結合形成復合體，在轉運因子NTF2和核孔蛋白等的協助下入核[9]。胞核內，在鳥苷酸交換因子RanGEF的作用下，Ran-GDP轉換為Ran-GTP導致三聚體構象改變進而將靶蛋白和Karyopherin α釋放到胞核。Karyopherin α再與胞核內其他Ran-GTP結合，被出核受體凋亡易感性蛋白(cellular apoptosis susceptibility，CAS)攜帶出核。剩下Karyopherin β1與Ran-GTP的二聚體通過核孔復合體回到細胞質。Ran-GTP在胞質中水解為RanGDP，而CAS再通過NPC入核，如此循環(huán)反復[10]。

圖1 胞核-胞質轉運通路示意圖[11]Fig 1 Schematic diagram of nuclear-cytoplasmic translocation pathway

2.2 核蛋白出核

在胞核內，出核轉運蛋白與含有NES的靶蛋白、Ran-GTP直接結合，形成出核轉運蛋白-靶蛋白-RanGTP三聚體復合物，穿過NPC出核。在胞質中，Ran-GTP活化蛋白(Ran-GTPase activating protein，Ran-GAP)與Ran結合蛋白(RanBP1)結合，將Ran-GTP去磷酸化成為Ran-GDP，靶蛋白被釋放。出核轉運蛋白再經NPC再次入核，從而完成靶蛋白的核質轉位[10,12]。CRM1(又叫XPO1)作為Karyopherin β家族中最主要的出核轉運蛋白，介導超過200個核蛋白出核。更重要的是，它是幾類重要的腫瘤相關蛋白唯一的出核轉運載體，包括：1)腫瘤抑制蛋白，如P53、P73、Rb、APC和BRCA1等。2)細胞周期調控蛋白，如：p21、p27和Tob。3)免疫反應調節(jié)因子，如：NF-κB抑制因子，IκB。4)癌基因，如：BCR-ABL。

5)化療靶點，如拓撲異構酶I和II[6]。因此，CRM1在腫瘤領域引起廣泛關注，其與結直腸癌、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤發(fā)生密切相關[13]。

3 核轉位調控

3.1 蛋白出核抑制劑

目前蛋白出核抑制劑研究主要集中于CRM1，CRM1抑制劑能結合其Cys528殘基，進而抑制其識別并結合含有NES區(qū)的靶蛋白。例如來普霉素B (Leptomycin B，LMB)，是第一個鑒定出來的CRM1特異性抑制劑，可與CRM1發(fā)生不可逆性結合，進而抑制CRM1介導的靶蛋白出核，但是因毒性較大而未能應用于臨床患者[14]。一系列的出核特異性抑制劑(selective inhibitors of nuclear export，SINE)，即KPT類水溶性化合物，包括KPT-127、KPT-185、KPT-214、KPT-251、KPT-276、KPT-330(Selinexor)和KPT-335(Verdinexor)等。SINE能與CRM1的活性氨基酸Cys528發(fā)生加成反應，從而抑制CRM1介導的靶蛋白出核[13]。

3.2 蛋白入核抑制劑

Karyopherin β在多種腫瘤中高表達，而抑制其表達能顯著誘導腫瘤細胞死亡；2016年Karyopherin β的特異性抑制劑INI-43[3-(1H-benzimidazol-2-yl)-1-(3-dimethylaminopropyl)被成功研發(fā)，通過抑制蛋白入核而發(fā)揮抗腫瘤效應[15]。芬維 A胺[N-(4-hydroxyphenyl)retinamide，4-HPR]能顯著抑制多種腫瘤，而且具有較小的副作用，因此備受研究人員青睞。目前，4-HPR作為抗腫瘤藥物已在多種腫瘤中開展I～II期臨床實驗，包括小細胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌和惡性腦膠質瘤等[16]。

3.3 靶蛋白修飾

核轉位對細胞生命活動的調節(jié)具有重要作用，因此其轉位調控逐漸受到重視。近期研究主要集中在：對靶蛋白NLS區(qū)、NES區(qū)修飾，包括靶蛋白的磷酸化、甲基化、乙?；头核鼗?，使靶蛋白滯留于胞質或胞核。例如：PFKFB3的乙酰化使其在胞質中蓄積，進而促進糖酵解，導致鉑耐藥[2]。Yes相關蛋白(Yes-associated protein，YAP)在多種腫瘤中高表達。YAP入核后能激活轉錄因子TEAD，促使下游癌基因轉錄和翻譯，進而發(fā)揮促癌效應。Hippo信號通路能磷酸化YAP，使其滯留于胞質而抑制其活性，因而能夠抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡[17]。

3.4 Ran的表達調控

Ran(a small nuclear GTP-binding protein)是Ras家族中的一員，是存在于真核細胞內的小分子GTP酶。貨物蛋白的核質運輸離不開Ran的協助。Ran在Ran-GTP和Ran-GDP兩種構像之間改變。在胞核內Ran-GTP可以促使入核的靶蛋白從入核聚合物上解離下來，同時促進出核復合物形成。在胞質中Ran-GTP則是被水解為Ran-GDP。因而Ran-GTP存在胞核內濃度高漿內濃度低的分布特點，這種濃度的差異使核質轉運更具方向性。倘若Ran表達發(fā)生改變，勢必影響靶蛋白正常功能的發(fā)揮。

3.5 蛋白相互作用

調節(jié)蛋白的核質分布，除了通過直接調節(jié)出入核轉運受體外，還可以通過與穩(wěn)定存在于胞質或胞核蛋白的相互作用實現[18]。一個含有NLS的蛋白，不能正常的通過核轉運的方式進入胞核。其中一個重要的原因在于其與穩(wěn)定表達于胞質的蛋白緊密結合，這種結合將其NLS入核序列遮蓋。同樣，一個含有NES出核轉運序列的蛋白滯留于胞核，也可能是由于與其他穩(wěn)定表達于胞核的相互作用導致其出核障礙。例如：核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，主要在胞核內發(fā)揮作用，然而，當它在胞質內與Iκ-B結合時，NF-κB的NLS序列就會被遮蓋，導致其不能入核，進而起到抑制腫瘤的作用[18]。

4 核轉位與腫瘤

4.1 核轉位與腫瘤的發(fā)生

腫瘤是一個基因的疾病，其發(fā)生的過程就是基因調控紊亂的過程，各種抑癌基因“不在其位而不謀其政”促使或加速了該過程的發(fā)生。其中比較經典的當屬抑癌基因P53的出核轉運了，該蛋白主要在胞核內通過轉錄調控來實現抑癌作用，而其出核轉位直接影響了抑癌作用的發(fā)揮[19]。近年來，隨著科學家們對核轉位現象認識的逐漸加深，越來越多的核轉位現象被發(fā)現，越來越多的腫瘤形成原因被揭露。值得注意的是，一些非癌基因或抑癌基因的的蛋白，由于核轉位的發(fā)生，產生了新的功能作用，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了巨大的推動作用。例如，在DNA損傷壓力下，胞質DNA識別受體環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)可以發(fā)生入核轉運，并在核內通過抑制細胞的同源重組(homologous recombination，HR)修復使得基因組不穩(wěn)定性增加，進而促進腫瘤的發(fā)生[20]。因此，在對腫瘤發(fā)生發(fā)展的認識上，不應該僅僅局限于基因的突變及蛋白量的改變上，充分意識到核轉位的作用可以使人們對腫瘤的發(fā)生發(fā)展認識更加全面。

4.2 核轉位與腫瘤的治療

基因的核轉位現象不僅在腫瘤的發(fā)生發(fā)展上占有舉足輕重的地位，針對于該現象的研究在腫瘤治療上也取得了令人振奮的成果。而目前針對于核質轉位的治療主要集中在以CRM1為代表的核轉運蛋白上。例如，CRM1的抑制劑selinexor在治療血液腫瘤上就取得了突破性進展[13]，該抑制劑不僅于2019年7月3日被美國食品和藥物管理局(FDA)批準上市，更是被寫進了NCCN指南。另外，在實體瘤的治療上，核轉運蛋白抑制劑也開始展露鋒芒。對于Kras基因突變的肺癌，一直以來都是無藥可靶向。而研究者卻發(fā)現抑制XPO1的selinexor會殺死依賴于Kras基因的肺癌細胞，這項發(fā)現可能會為難治性肺癌打開新世界的大門[21]。當然，關于Selinexor的研究不僅僅限于血液腫瘤和肺癌，目前相關的臨床試驗已在婦科腫瘤、腦癌、前列腺癌和頭頸癌等腫瘤中開展。相信在不久的將來，核轉運蛋白抑制劑會為腫瘤的治療史揭開新的篇章。

4.3 核轉位與腫瘤的耐藥

腫瘤的耐藥是腫瘤的治療過程中面臨的一個巨大的挑戰(zhàn)，而腫瘤耐藥的發(fā)生也伴隨了各種蛋白核轉位現象的發(fā)生。包括代謝相關蛋白的核轉位[2]、氧化還原相關蛋白核轉位[22]等，這些蛋白或基因的異常核質定位從多個角度影響了化療藥物的敏感性。更加值得注意的是，核轉位現象不僅發(fā)生在化療藥耐藥，同樣與靶向治療的耐藥也息息相關。例如，核蛋白激酶Cδ(PKCδ)作為多個已知TKI抗性機制共同軸，其核定位是TKI耐藥必須的，而TKI滅活的EGFR與涉及TKI抗性的其他膜受體二聚化可促進PKCδ核轉位，進而促使TKI耐藥的發(fā)生[23]。可以說核轉位現象已經滲入到腫瘤耐藥機制的方方面面。

5 問題與展望

腫瘤是基因的疾病，核轉位是基因異常表達的重要原因。目前針對基因的研究中，靶向基因的突變和過表達的藥已經使腫瘤治療得到了質的飛躍。而核轉位作為腫瘤中更為普遍的現象，發(fā)生在腫瘤的各階段，并參與各種生物學行為，與腫瘤的治療和耐藥息息相關。因此，靶向核轉位的治療存在著巨大的潛力，未來必將在腫瘤的治療史上留下濃墨重彩的一筆。然而，核轉位通路參與因素眾多、調控因子復雜，各因素間相互協同、制約，很難做到精準靶向。目前針對于核轉運蛋白的抑制劑雖然能改變蛋白的核質定位，但無法做到某一蛋白定位的精準改變，這就造成了副作用大等弊端。但是，隨著對核質轉位研究的不斷深入，以及基因技術的不斷成熟，高效性、特異性和低毒性的核轉位抑制劑有望成為惡性腫瘤的治療靶點。