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    肺癌與肺良性疾病特異血清免疫炎性蛋白質(zhì)N-糖基化修飾差異

    2020-08-10 13:41:02杜鈺瑩賴治臻田志新李智立
    關(guān)鍵詞:糖肽珠蛋白殘基

    杜鈺瑩,王 悅,賴治臻,田志新*,李智立*

    (1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物物理及結(jié)構(gòu)生物學(xué)系, 北京 100005;2.同濟(jì)大學(xué) 化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院 上海市化學(xué)品分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200092)

    肺癌(lung cancer)是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一[1]。慢性肺炎的癥狀與早期肺癌相似[2]。肺部疾病與多種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變相關(guān)[3-4],N-糖基化修飾是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的常見形式之一,它對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5],在不同的病生理狀態(tài)下蛋白質(zhì)N-糖基化修飾存在顯著差異[6-7]。目前大部分研究主要關(guān)注總蛋白質(zhì)的N-糖基化修飾[7],對(duì)疾病特異蛋白質(zhì)N-糖基化修飾報(bào)道的較少[8-10]。

    大量臨床樣本的研究證實(shí),血液中免疫炎性相關(guān)蛋白復(fù)合物(immunoinflammation-related protein complexes, IIRPCs)與慢性疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11],且其中的免疫球蛋白G(IgG)保守區(qū)(Fc)N-糖基化修飾可個(gè)體化區(qū)分良性疾病和癌[8,10]。本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)技術(shù),鑒定了肺癌和慢性肺炎患者血清中IIRPCs的蛋白質(zhì)N-聚糖和連接位點(diǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 研究對(duì)象:肺腺癌患者和慢性肺炎患者血清樣本各1份。樣本收集嚴(yán)格遵循人體醫(yī)學(xué)研究倫理要求,并經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批編號(hào):020-2014)。

    1.1.2 主要試劑:甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、三羥基甲基氨基甲烷、考馬斯亮藍(lán)G250、過(guò)硫酸銨、硼酸和四甲基乙二胺(Amresco公司);碳酸氫銨(Sigma-Fluka公司);色譜級(jí)乙腈和色譜級(jí)三氟乙酸(Thermo Fisher Scientific公司);測(cè)序級(jí)改良胰蛋白酶(Roche 公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 樣本前處理:采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(native-polyacrylamide gel electrophoresis,native-PAGE)從血清中分離IIRPCs[8]。血清用量為200 μL,電泳前以1∶1比例與1×native-PAGE上樣緩沖液混合。每塊凝膠以10 mA恒流電泳1.5 h,之后調(diào)整為25 mA恒流電泳3 h,凝膠用考馬斯亮藍(lán)G250染色。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法將IIRPCs目標(biāo)條帶切下[8,11],18.2 MΩ超純水清洗,置于600 μL離心管中。用胰蛋白酶(12.5 ng/μL,25 mmol/L NH4HCO3)酶解目標(biāo)條帶內(nèi)蛋白。吸取酶解液,用真空冷凍濃縮儀低溫干燥。采用石墨相氮化碳富集糖肽[9]。將肺癌(或良性疾病)樣本處理液平均分為兩份,一份用0.025%的氨水溶液洗脫,另一份用0.1%三氟乙酸水溶液洗脫。將兩份洗脫液混合后用真空冷凍濃縮儀濃縮,得到干燥的富集樣本。將干燥后的樣本用18.2 MΩ超純水重溶,濃度約為1 g/L。

    1.2.2 高效液相色譜分離條件:完整N-糖肽采用DionexUltiMate 3000 RSLCnano-HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分離,實(shí)驗(yàn)室自制分析柱(75 μm×75 cm,5 μm)和富集柱(200 μm×5 cm,5 μm)中的固定相均為Jupiter C18填料(5 μm,300 ?)。流動(dòng)相A為H2O(含0.2%甲酸),流動(dòng)相B為乙腈(含0.2%甲酸和4.8%的H2O)。上樣量為10 μL,以300 nL/min的流速進(jìn)行洗脫,梯度為:0~10 min(2% B),10~40 min(2%~40% B),40~45 min(40%~95% B),45~48 min(95% B)。

    1.2.3 質(zhì)譜檢測(cè):洗脫的完整N-糖肽,用Q Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行在線鑒定。離子傳輸管的溫度設(shè)定為280 ℃,噴霧電壓為2.8 kV,一級(jí)質(zhì)譜m/z采集范圍為700~2 000,質(zhì)量分辨率70 k(m/z 200),自動(dòng)增益控制(Automatic Gain Control,AGC)目標(biāo)值為2×105,最大注射時(shí)間為50 ms;二級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量分辨率設(shè)定為17.5 k,采用數(shù)據(jù)依賴性掃描模式(data-dependent acquisition,DDA)獲取強(qiáng)度前20的離子二級(jí)質(zhì)譜圖,設(shè)置高能碰撞誘導(dǎo)解離(higher-energy collisional dissociation,HCD)梯度碎裂能量依次為20%、30%和40%,AGC為5×105,最大注射時(shí)間為250 ms,隔離窗口寬度為3.0(m/z),動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)定為20.0 s。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    用GPSeeker蛋白質(zhì)及糖肽搜索軟件對(duì)上述采集到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。篩選與參考文獻(xiàn)[11]在IIRPCs中鑒定到的相同蛋白質(zhì)作為本次研究的目標(biāo)蛋白質(zhì),依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[12]對(duì)這些蛋白質(zhì)和糖肽進(jìn)行鑒定,其中糖基化殘基使用如下的單字母符號(hào)表示:巖藻糖,F(xiàn);半乳糖,G;甘露糖,M;唾液酸,S。

    2 結(jié)果

    2.1 蛋白質(zhì)及其糖肽的鑒定

    共鑒定了來(lái)自12種蛋白質(zhì)的89種糖肽(代表性質(zhì)譜圖見圖1),其中28種糖肽(31.5%)來(lái)源于IgG2,17種(19.1%)來(lái)源于IgG1,17種(19.1%)來(lái)源于IgA2,11種(12.4%)來(lái)源于觸珠蛋白,5種(5.6%)來(lái)源于補(bǔ)體C4b,2種(2.2%)來(lái)源于補(bǔ)體C3,2種(2.2%)來(lái)源于凝血酶原,2種(2.2%)來(lái)源于觸珠蛋白相關(guān)蛋白,2種(2.2%)來(lái)源于β2-糖蛋白1(圖2A)。89種糖肽中,21種僅在慢性肺炎樣本中測(cè)出,38種僅在肺腺癌樣本中測(cè)出(圖2B)。

    2.2 N-糖型結(jié)構(gòu)

    N-糖型通常含有1個(gè)五糖核心,根據(jù)其末端單糖殘基的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為高甘露糖型、復(fù)雜型和雜合型。本研究篩選出的89種糖肽包含63種糖型,其中55種糖型為復(fù)雜型,5種為雜合型,3種為高甘露糖型。10種糖型僅在慢性肺炎樣本中測(cè)出,21種糖型僅在肺腺癌樣本中測(cè)出(圖3)。

    A.mass spectrum of intact N-glycopeptide (glycoform: G0F) from IgG2 heavy chain at Asn176 site(black line: experimental isotopic peaks; red square: theoretical isotopic peaks); B.tandem mass spectrum of the intact N-glycopepetide; C.structure of intact N-glycopeptide including glycoform and sequence of amino acids

    A.glycopeptide distribution of the detected proteins; B.glycopeptide distribution between lung cancer and lung pneumonia圖2 糖肽的來(lái)源和分布Fig 2 Source and distribution of the detected glycopeptides

    2.3 N-糖基化修飾位點(diǎn)

    免疫球蛋白IgG1、IgG2和IgG4重鏈Fc N-糖基化修飾位點(diǎn)分別為γ1的Asn180位點(diǎn)、γ2的Asn176位點(diǎn)和γ4的Asn177位點(diǎn)。免疫球蛋白IgA2的N-糖基化修飾的位點(diǎn)為Asn205。觸珠蛋白的N-糖基化修飾位點(diǎn)為Asn241。補(bǔ)體C4b的N-糖基化修飾位點(diǎn)分別為Asn226和Asn1328,補(bǔ)體C3的N-糖基化修飾位點(diǎn)為Asn85,補(bǔ)體C6的N-糖基化修飾位點(diǎn)為Asn324。凝血酶原的N-糖基化修飾位點(diǎn)為Asn121。觸珠蛋白相關(guān)蛋白的N-糖基化修飾位點(diǎn)為Asn126。β2-糖蛋白1的N-糖基化修飾位點(diǎn)為Asn162。血漿蛋白C1抑制因子的N-糖基化修飾位點(diǎn)為Asn238(圖4)。

    圖4 糖蛋白質(zhì)的糖基化修飾結(jié)構(gòu)圖Fig 4 Structural diagram of the detected glycoprotein

    2.4 疾病特異糖型

    肺癌特異糖型(21種)中含有巖藻糖殘基的共18種, 占其總數(shù)的85.71%, 而慢性肺炎特異糖型(10種)中含有巖藻糖殘基的共8種,占其總數(shù)的80%。對(duì)肺癌,含有半乳糖殘基和唾液酸殘基的特異糖型分別為19種和10種,分別占其總數(shù)的90.48%和47.62%。對(duì)肺炎,含有半乳糖殘基和唾液酸殘基的特異糖型分別為5種和2種,分別占其總數(shù)的50%和20%(表1)。

    表1 不同糖型所占百分比Table 1 Percentage of different glycoforms

    慢性肺炎特異糖型中僅有2種單唾液酸化修飾糖型,而肺癌特異糖型中有6種單唾液酸化修飾糖型和4種雙唾液酸化修飾糖型。

    2.5 同一糖基化位點(diǎn)上的糖型與病理類型

    對(duì)肺炎,IgG1的Asn180位點(diǎn)可檢測(cè)到3種特有糖型,且均不含唾液酸殘基;對(duì)肺癌,該位點(diǎn)上可連接8種特有糖型,其中1種含有唾液酸殘基。IgG2的Asn176位點(diǎn)上在慢性肺炎中檢測(cè)到9種含有半乳糖殘基的特有糖型,在肺癌中僅檢測(cè)到4種含有半乳糖殘基的特有糖型。IgG4的Asn177位點(diǎn)上僅在慢性肺炎中檢測(cè)到1種糖型。

    對(duì)慢性肺炎,IgA2的Asn205位點(diǎn)上僅連接2種特有糖型,對(duì)肺癌,可檢測(cè)到12種特有糖型。對(duì)慢性肺炎,觸珠蛋白的Asn241位點(diǎn)上可連接2種特有糖型,肺癌僅有1種。IgA2與觸珠蛋白的N-糖型大部分含有唾液酸殘基。

    補(bǔ)體C4b的Asn226和Asn1328位點(diǎn)上各有1種慢性肺炎特有糖型。在肺癌中,補(bǔ)體C3的Asn85位點(diǎn)、凝血酶原的Asn121位點(diǎn)和β2-糖蛋白1的Asn162位點(diǎn)分別檢測(cè)到2種糖型,而在慢性肺炎中均未測(cè)出。觸珠蛋白相關(guān)蛋白的Asn126位點(diǎn)上連接的2種糖型僅出現(xiàn)在慢性肺炎中。血漿蛋白C1抑制因子的Asn238位點(diǎn)和補(bǔ)體C6的Asn324位點(diǎn)上各連接1種糖型,且僅出現(xiàn)在肺癌中。

    2.6 同一種N-糖型連接的位點(diǎn)與病理類型

    帶有一個(gè)半乳糖殘基的巖藻糖基化的糖型(G1F)連接在肺癌的IgG1上,而在慢性肺炎中它連接在IgG2上。帶有兩個(gè)半乳糖殘基的巖藻糖化的糖型(G2F)可以連接在肺癌的IgG1和IgG2上,但在慢性肺炎中僅發(fā)現(xiàn)連接在IgG2上。凝血酶原的Asn121位點(diǎn)、觸珠蛋白相關(guān)蛋白的Asn126位點(diǎn)與補(bǔ)體C4b的Asn1328位點(diǎn)均可連接2種糖型,分別為雙天線G2S2結(jié)構(gòu)與三天線G2S2結(jié)構(gòu)。對(duì)于凝血酶原,這2種糖型僅出現(xiàn)在肺癌中;對(duì)于觸珠蛋白相關(guān)蛋白,這2種糖型僅出現(xiàn)在慢性肺炎中;對(duì)于補(bǔ)體C4b,雙天線結(jié)構(gòu)G2S2僅出現(xiàn)在慢性肺炎中,三天線結(jié)構(gòu)G2S2在兩種病理狀態(tài)下均出現(xiàn)。

    3 討論

    不同蛋白質(zhì)N-糖基化修飾與疾病狀態(tài)密切相關(guān),如血清IgG、觸珠蛋白、受體酪氨酸激酶和E-鈣黏蛋白等[6,13]。目前,大部分研究主要對(duì)總蛋白質(zhì)的N-糖基化修飾進(jìn)行分析,對(duì)疾病特異蛋白質(zhì)糖基化修飾的研究較少[8-9]。分析疾病特異蛋白質(zhì)在病理狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)變化,對(duì)深入認(rèn)識(shí)發(fā)病機(jī)制和區(qū)分良惡性疾病具有重要的臨床意義。

    蛋白質(zhì)N-聚糖結(jié)構(gòu)的變化是由多種酶促反應(yīng)介導(dǎo)[13]。與肺炎相比,復(fù)雜的肺癌疾病特異免疫炎性蛋白質(zhì)N-糖型可能表明肺癌涉及更加復(fù)雜的酶促反應(yīng)。同一蛋白質(zhì)的特定N-糖基化修飾位點(diǎn)連接的不同糖型與疾病狀態(tài)和蛋白質(zhì)的功能調(diào)節(jié)相關(guān)[14]。與肺良性疾病相比,非小細(xì)胞肺癌的IIRPCs中觸珠蛋白Asn241位點(diǎn)的G2和G2S兩種糖型、Asn207/211位點(diǎn)的G2G3S糖型的表達(dá)顯著升高[9],同時(shí)IgG核心巖藻糖基化修飾水平顯著升高[10]。與慢性肺炎相比,肺腺癌患者的血清IgG的N-糖基化修飾可能會(huì)使其更易于與Fcγ結(jié)合,介導(dǎo)相關(guān)免疫反應(yīng),這可能與IgG Fc N-半乳糖基化修飾可促進(jìn)IgG與Fcγ受體之間的結(jié)合,導(dǎo)致抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用改變有關(guān)[15]。

    同一糖型連接在不同蛋白質(zhì)的N-糖基化修飾位點(diǎn)上,出現(xiàn)在不同的疾病狀態(tài)中,表明這種差異具有疾病特異性;同一糖型連接在同一蛋白質(zhì)的不同位點(diǎn)上也表現(xiàn)出疾病特異性[14]。因此,忽略糖型的連接位點(diǎn)或連接位點(diǎn)的特殊環(huán)境,單純從聚糖結(jié)構(gòu)探討疾病特異性具有一定的局限性。

    綜上所述,基于native-PAGE凝膠電泳和HPLC-MS/MS法,首次對(duì)疾病特異免疫炎性蛋白質(zhì)N-糖型的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定,發(fā)現(xiàn)了一批具有疾病特異的糖蛋白質(zhì)及相關(guān)的糖型。但由于本研究樣本量較小,研究具有一定的局限性,后續(xù)將進(jìn)行大樣本量的驗(yàn)證研究。

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