NLRP3炎性小體激活調(diào)控機(jī)制及抑制劑研究新進(jìn)展

周永婷，葉菜英，朱 蕾

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 藥理系， 北京 100005)

近年來(lái)，炎性小體(inflammasome)的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注。尤其是含NLR家族PYRIN域蛋白3(NLR family, pyrin domain containing protein 3, NLRP3)炎性小體，一直是免疫炎性反應(yīng)領(lǐng)域的重點(diǎn)研究對(duì)象，在機(jī)體免疫反應(yīng)和多種疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。NLRP3基因突變可導(dǎo)致冷炎素相關(guān)周期性綜合征(cryopyrin-associated autoinflammatory syndrome，CAFS)，而2型糖尿病、痛風(fēng)、動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病和腫瘤等與NLRP3炎性小體的過(guò)度激活密切相關(guān)。因此，深入探究NLRP3炎性小體激活機(jī)制對(duì)于發(fā)展其特異性抑制劑以及相關(guān)疾病的治療提供思路。有關(guān)NLRP3炎

性小體的組成和激活途徑等已有相關(guān)綜述，本文重點(diǎn)探討近年來(lái)NLRP3炎性小體活化調(diào)控機(jī)制及其抑制劑研究的新進(jìn)展。

1 NLRP3炎性小體激活模型

NLRP3炎性小體由核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide binding oligomerization domain，NOD)樣受體家族成員NLRP3、銜接蛋白ASC和半胱天冬蛋白酶caspase-1前體組成。經(jīng)典的NLRP3炎性小體激活需要雙重信號(hào)，分為兩個(gè)階段，即預(yù)激和活化階段。預(yù)激階段：信號(hào)1，如脂多糖(LPS)或細(xì)胞因子等病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)可活化NF-κB通路，上調(diào)NLRP3和IL-1β表達(dá)；活化階段：信號(hào)2，包括多種PAMPs和損傷相關(guān)分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)，它們活化的具體機(jī)制尚不明確，以往研究認(rèn)為可能與K+外流、活性氧類(reactive oxygen species，ROS)升高、溶酶體破裂、Ca2+信號(hào)和Cl-外流等相關(guān)，從而促進(jìn)NLRP3炎性小體復(fù)合物的組裝，使pro-caspase-1被剪切為有活性的caspase-1，后者將pro-IL-1β、pro-IL-18切割為成熟形式并引起細(xì)胞焦亡[1]。NIMA相關(guān)蛋白激酶7(NIMA-related kinase 7，NEK7)可以直接結(jié)合NLRP3 促進(jìn)炎性小體組裝和活化，有文獻(xiàn)認(rèn)為NEK7可能是NLRP3炎性小體的組分蛋白[1]。

2 NLRP3炎性小體激活調(diào)控機(jī)制

2.1 反面高爾基網(wǎng)(trans-Golgi network，TGN)解體

由于信號(hào)2的多樣性和高度差異性，且沒(méi)有證據(jù)表明能夠與NLRP3直接結(jié)合，推測(cè)信號(hào)2可能通過(guò)激發(fā)一個(gè)共同細(xì)胞信號(hào)從而活化NLRP3炎性小體，但一直未得到解答。通過(guò)建立一個(gè)創(chuàng)新性的能夠有效檢測(cè)NLRP3活性的體外分析系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)不同信號(hào)2可導(dǎo)致TGN解體成分散的TGN(dispersed TGN，dTGN)，后者作為一個(gè)平臺(tái)，其膜上帶負(fù)電荷的磷脂酰肌醇-4-磷酸通過(guò)與NLRP3上保守的帶正電荷的多堿區(qū)結(jié)合從而招募NLRP3聚集于dTGN上形成斑點(diǎn)，使NLRP3分子活化，然后進(jìn)一步招募ASC并引起炎性小體激活[2]。雖然信號(hào)2如何誘導(dǎo)dTGN形成仍不清楚，但這一發(fā)現(xiàn)揭示NLRP3在dTGN上募集是多樣化信號(hào)2活化NLRP3炎性小體的早期共同信號(hào)，為相關(guān)疾病治療提供了新靶點(diǎn)。

2.2 線粒體與NLRP3

線粒體在NLRP3炎性小體活化中起重要作用。已有報(bào)道，多種PAMPs和DAMPs可引起線粒體功能障礙，釋放ROS和線粒體DNA(mtDNA)以及產(chǎn)生氧化mtDNA(ox-mtDNA)，從而激活NLRP3炎性小體。而線粒體自噬可以負(fù)調(diào)控NLRP3炎性小體。另外，NLRP3炎性小體組分蛋白的線粒體定位對(duì)于其活化具有重要作用，線粒體相關(guān)適配蛋白、c-FLP和線粒體心磷脂可調(diào)節(jié)定位過(guò)程[3]。信號(hào)1-LPS可以通過(guò)TLR-MyD88/TRIF- IRF1通路上調(diào)尿苷酸-胞苷酸激酶2(UMP-CMPK2)的表達(dá)。UMP-CMPK2是mtDNA合成中dNTP供應(yīng)的限速酶，LPS誘導(dǎo)的UMP-CMPK2依賴性mtDNA合成是多種信號(hào)2產(chǎn)生ox-mtDNA并進(jìn)而激活NLRP3炎性小體所必需的。該項(xiàng)研究首次將預(yù)激階段和活化階段聯(lián)系起來(lái)，同時(shí)也提示抑制UMP-CMPK2可能為NLRP3相關(guān)疾病治療提供新策略[4]。

2.3 NLRP3的翻譯后修飾(圖1)

2.3.1 NLRP3泛素化:信號(hào)1不僅可以增加NLRP3轉(zhuǎn)錄，還可以調(diào)節(jié)其泛素化修飾從而影響其活化。LPS通過(guò)TLR4/MyD88 通路使NLRP3去泛素化從而激活NLRP3炎性小體，該過(guò)程依賴線粒體ROS的產(chǎn)生。含BRCA1/BRCA2復(fù)合體亞基3(BRCA1/BRCA2-containing complex subunit 3，BRCC3)可介導(dǎo)NLRP3的LRR域去泛素化，促進(jìn)NLRP3寡聚化和活化。而維生素D受體(VDR)激活后可直接結(jié)合NLRP3，阻滯BRCC3去泛素化NLRP3，從而抑制NLRP3炎性小體活化[5]。而一些E3泛素連接酶可以使NLRP3泛素化從而負(fù)調(diào)控NLRP3炎性小體的活化。FBXL2是SCF E3連接酶復(fù)合物的亞基，可介導(dǎo)NLRP3 Lys689位點(diǎn)的泛素化和蛋白酶體降解[6]。而LPS可誘導(dǎo)SCF的另一亞基——FBXO3，F(xiàn)BXO3降解FBXL2從而避免NLRP3被泛素化而降解[6]。另兩個(gè)E3泛素連接酶，ARIH2和TRIM31亦可促進(jìn)NLRP3的泛素化降解從而抑制NLRP3炎性小體的活化；而信號(hào)1可使TRIM31的表達(dá)上調(diào)從而對(duì)NLRP3炎性小體活化起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。多巴胺可以作為NLRP3炎性小體的內(nèi)源性抑制劑，它與D1受體結(jié)合后增加胞內(nèi)cAMP水平，cAMP與NLRP3結(jié)合促進(jìn)E3泛素連接酶MARCH7介導(dǎo)的NLRP3泛素化和降解[7]。與上述大量報(bào)道的NLRP3的泛素化作為負(fù)調(diào)控信號(hào)所不同的是，最近研究顯示Pellino 2可以使NLRP3泛素化從而促進(jìn)NLRP3的組裝和活化。

2.3.2 NLRP3磷酸化:一些激酶和磷酸酶可以調(diào)節(jié)NLRP3上相應(yīng)位點(diǎn)的磷酸化修飾狀態(tài)從而影響其活化。JUN氨基末端激酶1(JNK1)和蛋白激酶D(PKD)分別磷酸化NLRP3的Ser198和Ser295位點(diǎn)，從而促進(jìn)NLRP3炎性小體激活，同時(shí)Ser198的磷酸化還可以通過(guò)促進(jìn)BRCC3的結(jié)合和去泛素化來(lái)激活NLRP3炎性小體[8]。然而，NLRP3的磷酸化也可以抑制其活化。PYD結(jié)構(gòu)域的Ser5發(fā)生磷酸化后與ASC蛋白PYD結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生靜電斥力從而抑制NLRP3炎性小體活化，蛋白磷酸酶2A(PP2A)使該位點(diǎn)去磷酸化，從而促進(jìn)NLRP3和ASC的相互作用。蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22，PTPN22)可以使NLRP3的Tyr861位點(diǎn)去磷酸化而促進(jìn)其活化。膽酸或前列腺素E2可以通過(guò)蛋白激酶A(PKA)介導(dǎo)的NLRP3的Ser295位點(diǎn)磷酸化，降低ATP酶活性而抑制NLRP3炎性小體的激活[9]。PKA和PKD介導(dǎo)的Ser295磷酸化對(duì)NLRP3炎性小體活化產(chǎn)生了相反的影響，這可能與磷酸化修飾發(fā)生的時(shí)間以及同時(shí)發(fā)生的其他翻譯后修飾有關(guān)，但需要進(jìn)一步的研究。

2.3.3 NLRP3小泛素相關(guān)修飾物化(SUMO):Sumoylation(SUMO)是類泛素蛋白家族的重要成員，目前哺乳動(dòng)物中有4種亞型(SUMO1～4)，SUMO化修飾過(guò)程與泛素化類似。細(xì)胞在靜息狀態(tài)時(shí)，SUMO E3連接酶MAPL介導(dǎo)的NLRP3 SUMO2/3化修飾可以抑制NLRP3活化；而信號(hào)2可以通過(guò)SUMO 特異性蛋白酶(SENP6和7)使NLRP3去SUMO2/3化，從而促進(jìn)NLRP3炎性小體活化[10]。而另一項(xiàng)研究顯示，SUMO E2連接酶UBC9催化NLRP3 Lys204位點(diǎn)發(fā)生SUMO1化修飾，從而促進(jìn)ASC寡聚化和炎性小體活化；當(dāng)SENP3催化NLRP3去SUMO1化后可抑制NLRP3炎性小體活化[10]。SUMO化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究的新熱點(diǎn)，其對(duì)NLRP3炎性小體活化的調(diào)節(jié)可能與修飾的位點(diǎn)以及SUMO亞型相關(guān)，還需進(jìn)一步深入研究。

2.3.4 NLRP3與其他翻譯后修飾:NLRP3亦可被烷基化和S-亞硝基化修飾。烷基化對(duì) NLRP3抑制作用的發(fā)現(xiàn)來(lái)自于抑制劑的研究，Bay11-7082、MNS、丙烯酰胺衍生物和BOT-4-one等抑制劑使NLRP3烷基化而抑制其激活。預(yù)測(cè)NLRP3 ATP酶催化口袋的Cys419是烷基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)烷基化后降低NLRP3與ATP結(jié)合的親和力，從而抑制ATP酶活性和NLRP3炎性小體激活。NLRP3烷基化也可能通過(guò)增加其泛素化水平來(lái)抑制其激活。此外研究報(bào)道，一氧化氮可以使NLRP3發(fā)生S-亞硝基化修飾從而抑制NLRP3炎性小體激活。

GPBAR1：G-蛋白偶聯(lián)膽酸受體1；PTGER4：前列腺素E2受體EP4亞型;DRD1：D1A多巴胺受體圖1 NLRP3蛋白翻譯后修飾示意圖Fig 1 Post-transcriptional modifications of NLRP3

2.4 其他

一些蛋白通過(guò)促進(jìn)自噬而抑制NLRP3炎性小體激活。與克羅恩病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的免疫相關(guān)GTP酶M通過(guò)與NLRP3和ASC蛋白結(jié)合，促進(jìn)選擇性自噬降解，抑制NLRP3炎性小體激活，對(duì)腸道炎性反應(yīng)具有保護(hù)作用[11]；在阿爾茨海默病(AD)中，自噬蛋白Beclin1介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3的選擇性自噬降解，從而抑制神經(jīng)炎性反應(yīng)中促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的產(chǎn)生[12]。

另外，一些蛋白，如巨噬細(xì)胞遷移抑制因子[13]、微管親和調(diào)節(jié)激酶4[14]、肌醇酶1α[15]、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶ω1-1[16]在NLRP3炎性小體激活中必不可少。研究報(bào)道，細(xì)胞在受到應(yīng)激時(shí)，可以形成應(yīng)激顆粒促進(jìn)細(xì)胞存活，也可以形成炎性小體使細(xì)胞發(fā)生焦亡。應(yīng)激顆粒的組成蛋白DDX3X可以促進(jìn)NLRP3炎性小體激活，而應(yīng)激顆粒的形成隔離了DDX3X與NLRP3的相互作用從而抑制NLRP3炎性小體激活，因此DDX3X通過(guò)調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體決定應(yīng)激細(xì)胞的生死[17]。

上述研究表明NLRP3炎性小體調(diào)節(jié)的廣泛性和復(fù)雜性，而這些蛋白也為抑制NLRP3炎性小體激活以及相關(guān)疾病治療提供了新的重要治療靶點(diǎn)。

3 NLRP3炎性小體抑制劑

目前臨床治療NLRP3炎性小體相關(guān)疾病的策略是靶向下游產(chǎn)物IL-1β，但這對(duì)同時(shí)產(chǎn)生的IL-18以及細(xì)胞焦亡沒(méi)有影響。隨著對(duì)其激活機(jī)制的深入探討，作用于NLRP3或其他組分蛋白或相關(guān)信號(hào)通路的藥物開(kāi)發(fā)成為NLRP3炎性小體抑制劑的研究熱點(diǎn)，尤其是直接靶向NLRP3分子的藥物因更具特異性和有效性而引起廣泛關(guān)注(表1)，下面重點(diǎn)介紹研究較為深入的幾種抑制劑。

表1 直接靶向NLRP3的抑制劑及其特點(diǎn)[1]Table 1 Inhibitors that directly targeting NLRP3 and their characteristics

3.1 MCC950

MCC950(CRID3，CP-456773)，是二芳基磺酰脲的衍生物，是目前作用最強(qiáng)的NLRP3炎性小體抑制劑，且抑制作用具有特異性，對(duì)其他炎性小體無(wú)影響。早期研究認(rèn)為MCC950的作用機(jī)制是抑制ASC多聚化[18]，而新近研究證實(shí)MCC950直接與NLRP3 NACHT結(jié)構(gòu)域Walker B模序結(jié)合，阻礙NLRP3水解ATP從而抑制 NLRP3炎性小體激活。NLRP3 NACHT結(jié)構(gòu)域ATP結(jié)合口袋的完整性影響其與MCC950的結(jié)合，CAPS的很多突變位點(diǎn)影響了ATP結(jié)合口袋的完整性從而使MCC950不能結(jié)合，因此作者提出MCC950可能對(duì)野生型NLRP3形成的炎性小體更有效[19]。MCC950對(duì)多種NLRP3相關(guān)疾病的動(dòng)物模型具有良好改善作用，包括Nlrp3A350VCAPS、敗血癥、實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎、AD、帕金森病、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、糖尿病、非酒精性脂肪肝和結(jié)腸炎等模型。而一項(xiàng)MCC950治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的Ⅱ期臨床試驗(yàn)因?yàn)槠涓闻K毒性而終止，因此其應(yīng)用前景還需進(jìn)一步觀察[20]。

3.2 CY-09

CY-09是對(duì)小分子化合物CFTR(inh)-172結(jié)構(gòu)改造而來(lái)，對(duì)NLRP3炎性小體的抑制作用具有特異性。CY-09能夠直接與NLRP3 NACHT結(jié)構(gòu)域的Walker A模序結(jié)合，抑制NLRP3的ATP酶活性和多聚化，從而抑制NLRP3炎性小體激活。在小鼠腹膜炎模型、CAPS模型以及高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病模型中，CY-09均顯示出良好的改善作用[21]。

3.3 OLT1177

OLT1177對(duì)NLRP3炎性小體具有特異性抑制作用。機(jī)制上，OLT1177抑制NLRP3-ASC相互作用，進(jìn)而影響NLRP3多聚化。此外，它還能夠抑制NLRP3的ATP酶活性[22]。在小鼠痛風(fēng)模型中，OLT1177通過(guò)抑制NLRP3炎性小體的活化從而發(fā)揮良好的改善作用[23]。

3.4 曲尼斯特

曲尼斯特是治療過(guò)敏性疾病的上市藥物，但作用機(jī)制一直未明。直到最近報(bào)道，曲尼斯特直接與NLRP3 NACHT結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻礙了NLRP3-NLRP3的相互作用和多聚化，但并不影響ATP酶活性，從而抑制了后續(xù)NLRP3炎性小體的組裝和激活。與前面NLRP3抑制劑不同的是，曲尼斯特可以抑制NF-κB通路，減少LPS刺激的pro-IL-1β和IL-6生成，提示其可能通過(guò)多途徑抑制NLRP3炎性小體激活[24]。

3.5 冬凌草甲素

冬凌草甲素是傳統(tǒng)中藥冬凌草的二萜類提取物，具有抗癌和抗感染作用。它可以通過(guò)碳碳雙鍵與NLRP3 NACHT結(jié)構(gòu)域Cys279不可逆結(jié)合，影響NLRP3-NEK7相互作用，干擾炎性小體組裝和激活。盡管冬凌草甲素對(duì)NF-κB和MAPK通路也有抑制作用，但抑制所需濃度是抑制NLRP3炎性小體所需濃度的10倍。另外，冬凌草甲素對(duì)于腹膜炎、痛風(fēng)和2型糖尿病的動(dòng)物模型亦具有良好療效[25]。

4 問(wèn)題與展望

近年來(lái)，對(duì)NLRP3炎性小體的研究雖然取得較大進(jìn)展，但由于其復(fù)雜性和多樣性，對(duì)其具體激活和調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍然有限，臨床上也缺乏靶向NLRP3炎性小體的有效治療藥物，因此，繼續(xù)深入探究NLRP3炎性小體的活化調(diào)控機(jī)制，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并研發(fā)針對(duì)NLRP3分子或多樣化刺激劑引起其活化的共同關(guān)鍵信號(hào)通路特異性抑制劑有望為相關(guān)疾病的治療帶來(lái)新的希望。