靳三針通過調(diào)控鈣結合蛋白PV、CB表達抑制腦卒中肢體痙攣大鼠肌張力增高的機制研究?

黃秀容 張子強 方宣瓊 袁 青

（1.廣東省深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳 518001；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510405）

腦卒中（Stroke）是一種常見腦血管疾病，又稱中風或腦血管意外，發(fā)病率高、復發(fā)率高，致殘率及致死率亦高，已成為導致全球患者死亡的第二大原因［1］。該病好發(fā)于40歲以上人群，男性多于女性，是我國成年人殘疾的首要原因，約50%～83%患者存在不同程度肢體癱瘓，而腦卒中痙攣狀態(tài)是以上殘疾者中重要并發(fā)癥之一，嚴重影響患者獨立生活能力及生活質(zhì)量［2-3］。中醫(yī)學將痙攣歸為“筋病”“痙證”范疇，與陰陽失調(diào)、筋脈失養(yǎng)等有關［4］。針灸是臨床治療腦卒中后肢體痙攣常用方法，操作方便、價格低廉，患者接受度高且無副作用。靳三針療法是一種特定配穴針刺療法，可促進弱智兒童、腦癱及缺血性腦卒中患者大腦發(fā)育，改善其適應性行為，但靳三針療法對腦卒中后痙攣患者肌張力的降低是否有影響及其作用機制尚不明確［5-6］?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，腦卒中后肢體痙攣可能與脊髓上神經(jīng)通路反射亢進有關，鈣結合蛋白小白蛋白（PV）、鈣結合蛋白D（CB）與Ca2+親和力很強，在腦內(nèi)分布廣泛，可抵抗腦內(nèi)Ca2+超載，與神經(jīng)元興奮性傳遞有關，而肌張力由運動神經(jīng)元產(chǎn)生［7-8］。基于此，本研究擬通過探究靳三針對腦卒中肢體痙攣大鼠肌張力及PV、CB蛋白表達影響，以期揭示靳三針治療作用機制。現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

32只成年健康6周齡SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～200 g，購自南京君科生物工程有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2018-0021，使用許可證號：SYXK（蘇）2018-0047，合格證號：0019012806。大鼠均于（23±2）℃、（50±10）%濕度、12 h/12 h（光照/黑暗環(huán)境），自由飲水飲食條件下適應性飼養(yǎng)1周。本實驗經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學和深圳市人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 試藥與儀器

蛋白抽提試劑盒（貨號：P0028）、BCA蛋白定量試劑盒（貨號：P0010S）購自上海碧云天有限公司；鼠源一抗anti-PV（貨號：PA1-933）、anti-GAPDH（貨號：AM4300），兔源anti-CB（貨號：PA5-85669），二抗羊抗鼠IgG（貨號：A-11001）、羊抗兔IgG（貨號：A-11008）均購自美國Invitrogen公司。MODEL550型酶標儀購自美國Bio-Rad公司；BL-420F型生理記錄儀購自成都泰盟軟件有限公司；華佗牌一次性無菌針（編號：41.12270009，注冊證號：蘇械注準20162270970號，規(guī)格：直徑0.25 mm，長13 mm）購自蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；中動脈栓塞（MCAO）線栓（型號：503356PK5Re）購自天津敏學科技有限公司。

1.3 造模及分組

參照改良Zea Longa法［9］，隨機選取22只SD大鼠采用2%異戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）麻醉后，切開皮膚，分離頸總動脈，頸內(nèi)、頸外動脈，結扎后插入MCAO線栓制備右側(cè)大腦MCAO肢體痙攣模型。造模后連續(xù)3 d腹腔注射2萬U慶大霉素防止術后感染。術后注射速尿（0.1 mg/kg）防止腦水腫，并采用保溫燈照射保證術后大鼠肛溫37℃左右。造模后，采用Bederson評分標準［10］對神經(jīng)功能進行評分，≥1分表示腦卒中模型制備成功；造模后第3日采用改良Ashworth標準［11］對肌張力情況進行分級，≥1級表示大鼠存在肌張力增高、被動活動困難、共濟失調(diào)等痙攣表現(xiàn)。本研究以Bederson評分1～3分且Ashworth分級≥1級作為腦卒中肢體痙攣模型制備成功的標準，共2只死亡，造模成功20只，隨機分為模型組和靳三針組，每組10只。另取10只大鼠為假手術組，僅切開皮膚，分離頸總動脈，頸內(nèi)、頸外動脈，不插入MCAO線栓，直接消毒縫合。術后處理同模型組。

1.4 干預方法

于造模手術后3 d開始進行靳三針治療。參照李忠仁主編《實驗針灸學》［12］及華興邦等［13］報道人與動物骨度類比取穴，患側(cè)顳三針：第一針，耳尖直上發(fā)際50 mm處；與第一針同水平處向前25 mm為第二針，向后25 mm為第三針。采用捻針手法進針，快速捻轉(zhuǎn)2～3 min，顳三針先垂直刺入皮下，達帽狀腱膜下后沿皮平刺；足三里直刺進針；鼠蹊于腹股溝動脈搏動處外側(cè)進針；陽陵泉透刺進針；三陰交沿脛骨后緣懸刺進針。針刺后留針30 min，每天1次，治療6 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 Bederson神經(jīng)功能缺損程度評分 于造模術后1 d、3 d（治療前）、9 d（治療后）采用雙盲法參照Bederson評分標準［10］對3組大鼠進行神經(jīng)功能缺損程度評分：輕提大鼠尾巴遠離桌面10 cm，輕推大鼠肩膀，直至前肢滑動數(shù)厘米，并選擇不同方向重復數(shù)次。正常大鼠2個前爪向桌面方向伸直，在不同方向抵抗力一致，而腦損傷大鼠偏癱側(cè)前肢屈曲。無神經(jīng)功能缺損記為0分；前肢屈曲，提尾實驗陽性記為1分；側(cè)推抵抗力下降，伴前肢屈曲，無轉(zhuǎn)圈行為記為2分；伴自發(fā)性轉(zhuǎn)圈行為、自由運動時向偏癱側(cè)劃圈記為3分。

1.5.2 電生理描記法測定肌張力 分別于術后3 d（治療前）、9 d（治療后）測定各組大鼠間接肌張力，各組大鼠淺度全身麻醉后采用BL-420F型生理記錄儀測定間接肌張力［14］，將電極一端插入大鼠尾部，另一端于右后肢肱四頭肌，并與其下端系一根順應性棉線，連接于生理記錄儀，給予0.5 g后負荷，定時以3 mA，30 s刺激大鼠肱四頭肌，記錄產(chǎn)生的電信號，即間接反映肌張力，用以表示大鼠肢體痙攣程度。肌張力越高，刺激痙攣機體被動運動幅度越小，對棉線牽拉力則越小，描記出來電信號越低，反之亦然。

1.5.3 Feeney平衡木評分［15］于術后 1 d、3 d（治療前）、9 d（治療后）采用雙盲法對各組大鼠進行評分。讓大鼠在距離地面10 cm高度的80 cm×2.5 cm長方形平衡木板上行走，測定其運動功能。大鼠可跳上平衡木，行走時不會跌倒記為0分；跌倒機會小于50%記為1分，跌倒機會大于50%記為2分；大鼠在健側(cè)后肢協(xié)助下能跳上平衡木，但偏癱后肢不能協(xié)助肢體前移記為3分；人為放置大鼠于平衡木上，大鼠可坐在平衡木上但不能行走記為4分；將大鼠放置于平衡木上大鼠無法正常坐立，會掉下平衡木記為5分。評分越高，運動能力越差。

1.5.4 Western blotting檢測大鼠腦干組織中鈣結合蛋白PV、CB表達 其他指標觀察結束后，各組大鼠用2%異戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）麻醉后剪斷股動脈處死，取適量腦干組織于凍存管中，立即置于液氮中保存?zhèn)溆?。采用蛋白抽提試劑盒提取腦干組織總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，置于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?0 mg蛋白樣品，80 mV電壓下6%SDS-PAGE電泳2 h，250 mA下PVDF膜轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBS稀釋一抗anti-PV（0.1 mg/mL）、anti-CB（稀釋比1∶500）、anti-GAPDH抗體（稀釋比1∶500）4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，二抗 IgG（1∶5 000）室溫孵育1.5 h，按上述方法洗膜，用免疫印記化學發(fā)光試劑（ECL）顯色，數(shù)字化多功能圖像增強化學發(fā)光系統(tǒng)曝片，觀察并分析結果。

1.6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS25.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較

見表1。術后1 d、3 d（治療前）、9 d（治療后），假手術組無神經(jīng)功能功能缺損癥狀，與假手術組比較，模型組、靳三針組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分顯著升高（P＜0.05）；術后9 d（治療后），與模型組比較，靳三針組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分顯著降低（P＜0.05）；與術后3 d（治療前）比較，術后9 d（治療后）靳三針組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較（分，±s）

與本組術后1 d比較，?P＜0.05；與本組術后3 d（治療前）比較，#P＜0.05；與假手術組同時期比較，△P＜0.05；與模型組同時期比較，▲P＜0.05。下同

組別假手術組模型組靳三針組n 10 10 10術后1 d 0.00±0.00 2.19±0.43△2.06±0.42△術后3 d（治療前）0.00±0.00 2.01±0.39△1.96±0.38△術后9 d（治療后）0.00±0.00 1.68±0.33*△0.67±0.15*#△▲

2.2 各組大鼠電生理描記間接肌張力結果比較

見表2。術后3 d（治療前）、術后9 d（治療后），與假手術組比較，模型組、靳三針組大鼠間接肌張力顯著降低（P＜0.05）；術后9 d（治療后），與模型組比較，靳三針組大鼠間接肌張力顯著升高（P＜0.05）；與術后3 d（治療前）比較，術后9 d（治療后）靳三針組大鼠間接肌張力顯著升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠電生理描記間接肌張力結果比較（±s）

表2 各組大鼠電生理描記間接肌張力結果比較（±s）

組別假手術組模型組靳三針組n 10 10 10術后3 d（治療前）7.68±1.23 4.11±0.79△3.97±0.68△術后9 d（治療后）7.51±1.34 4.28±0.73△5.64±0.82#△▲

2.3 各組大鼠運動功能比較

見表3。術后1 d、3 d（治療前）、9 d（治療后），與假手術組比較，模型組、靳三針組大鼠Feeney平衡木行走評分顯著升高（P＜0.05）；術后9 d（治療后），與模型組比較，靳三針組大鼠Feeney平衡木行走評分顯著降低（P＜0.05）；與術后1 d、3 d（治療前）比較，術后9 d（治療后）靳三針組大鼠Feeney平衡木行走評分顯著較低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠Feeney平衡木行走評分比較（分，±s）

組 別n 術后1 d 術后3 d（治療前）術后9 d（治療后）10 10 10假手術組模型組靳三針組0.00±0.00 4.12±0.81△3.87±0.74△0.00±0.00 3.53±0.69△3.16±0.65△0.00±0.00 2.71±0.54△1.69±0.35*#△▲

2.4 各組大鼠腦干組織中鈣結合蛋白PV、CB表達水平比較

見表4，圖1。術后3 d（治療前）、術后9 d（治療后），與假手術組比較，模型組、靳三針組大鼠腦干組織中鈣結合蛋白PV、CB表達水平顯著降低（P＜0.05）；術后9 d（治療后），與模型組比較，靳三針組大鼠腦干組織中鈣結合蛋白PV、CB表達水平顯著升高（P＜0.05）；與術后3 d（治療前）比較，術后9 d（治療后）靳三針組大鼠腦干組織中鈣結合蛋白PV、CB表達水平顯著升高（P＜0.05）。

表4 各組大鼠腦干組織中鈣結合蛋白PV、CB表達水平比較（±s）

表4 各組大鼠腦干組織中鈣結合蛋白PV、CB表達水平比較（±s）

組別假手術組（n=10）模型組（n=10）靳三針組（n=10）時間術后3 d（治療前）術后9 d（治療后）術后3 d（治療前）術后9 d（治療后）術后3 d（治療前）術后9 d（治療后）PV 1.12±0.11 1.13±0.10 0.27±0.04△0.19±0.03△0.29±0.05△0.71±0.09#△▲CB 1.09±0.12 1.08±0.11 0.28±0.06△0.19±0.04△0.17±0.04#△0.93±0.10#△▲

圖1 各組大鼠腦干組織中PV、CB蛋白表達

3 討 論

目前多采用MACO線栓法制備腦卒中模型，該法穩(wěn)定性好，可使缺血時間和再灌注具有可控性，被認為是腦卒中局灶性缺血標準模型［16］。本研究中采用MACO法造模，共計20只大鼠Bederson評分1～3分且Ashworth分級≥1級，表明腦卒中肢體痙攣大鼠模型制備成功，用于后續(xù)實驗。腦卒中多伴隨肢體痙攣并發(fā)癥，多項研究采用大鼠肌張力反映其肢體痙攣狀態(tài)［14，17］。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術組比較，模型組、靳三針組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分、Feeney平衡木行走評分顯著增加，間接肌張力顯著降低，提示本研究中模型大鼠存在神經(jīng)功能損傷、運動能力降低、肢體痙攣等病癥。

痙攣屬中醫(yī)“筋病”“痙證”范疇。據(jù)《難經(jīng)·二十九難》中記載“陰蹺為病，陽緩而陰急；陽蹺為病，陰緩則陽急”。蹺脈通于腦，中風后腦受損可致陰陽蹺脈功能失衡異常，脈氣不能相交，導致肢體內(nèi)外側(cè)筋肉陰陽脈氣失衡，表現(xiàn)為拮抗肌遲緩無力，原動肌拘急痙攣，運動功能減退或喪失。又如《醫(yī)貫·中風要旨》記載“其手足牽掣，口眼歪斜，乃水不榮筋，筋急而縱也”［18］。靳三針中“顳三針”可平肝潛陽，息風瀉火，疏通肝膽經(jīng)絡氣血；“足三針”取穴刺之可將脛神經(jīng)分支、外側(cè)神經(jīng)密集處及腓腸神經(jīng)等信息傳入脊髓，再由傳出神經(jīng)沖動傳至下肢癱瘓肌肉，產(chǎn)生肌肉收縮反射；“攣三針”是治療偏癱痙攣狀態(tài)的主要穴位，注重肢體肌群陰陽穴配合互濟，協(xié)調(diào)肌張力平衡，抑制痙攣［19-20］。田亮等［21］研究報道，靳三針療法可有效改善額葉損傷大鼠執(zhí)行功能和空間學習記憶力。石新濤等［6］研究報道，消栓通絡顆粒聯(lián)合靳三針可通過減輕患者痙攣程度、神經(jīng)缺損功能，改善患者運動能力。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與術后3 d（治療前）比較，術后9 d（治療后）靳三針組大鼠神經(jīng)功能評分、運動能力評分均顯著降低，間接肌張力增加，提示靳三針可有效改善腦卒中大鼠神經(jīng)功能，緩解肢體痙攣狀態(tài)，增加運動能力。

γ-氨基丁酸（GABA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要抑制性遞質(zhì)，GABA神經(jīng)元由PV、CB及鈣視網(wǎng)膜蛋白（CR）3種含鈣結合蛋白亞群構成，與上運動神經(jīng)元受損后肌張力升高關系密切［17］。毛雪蓮等［15］研究報道，電針可通過增加GABA代謝改善腦卒中肢體痙攣狀態(tài)，降低大鼠肌張力。伍芳等［14］研究報道，電針治療可提高缺血性腦卒中大鼠腦干、頸膨大及腰膨大組織PV、CB蛋白表達，緩解其肢體痙攣狀態(tài)。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與術后3 d（治療前）比較，術后9 d（治療后）靳三針組大鼠腦干組織中PV、CB蛋白表達水平顯著增加，提示靳三針可能通過上調(diào)腦干組織中PV、CB蛋白表達抑制腦卒中后痙攣大鼠肌張力增加，緩解其痙攣狀態(tài)。

綜上所述，靳三針可能通過上調(diào)鈣結合蛋白PV、CB表達抑制腦卒中肢體痙攣大鼠肌張力增高，緩解其痙攣狀態(tài)。但是否涉及其他代謝通路參與尚不完全清楚，有待進一步深入探究。