補腎壯督方對大鼠退變髓核組織中miR-155-5p及凋亡相關(guān)蛋白的影響＊

周文明，林一峰，張 震，白榮飛

（1. 廣州中醫(yī)藥大學 廣州 510000；2. 廣州中醫(yī)藥大學附屬骨傷科醫(yī)院 廣州 510240；3. 深圳市沙井人民醫(yī)院 深圳 518104；4. 廣東省中醫(yī)院 廣州 510030）

椎間盤退行性病變（intervertebral disc degeneration，IDD）是造成腰腿痛的重要原因之一[1]。研究表明，過度的細胞凋亡引起的髓核細胞減少在椎間盤退變中起著關(guān)鍵作用[2]。Gruber 等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在術(shù)中取出的退變和衰老的椎間盤，其細胞凋亡率為53%-73%。在髓核細胞凋亡中，線粒體凋亡通路發(fā)揮著重要作用[4]。近年來，miRNA 與髓核細胞凋亡之間的關(guān)系受到關(guān)注，其中有文獻報道m(xù)iR-155 參與了髓核細胞凋亡的調(diào)控[5-6]。

補腎壯督方是林一峰教授通過長期臨床所得的經(jīng)驗方，主要由鹿角膠、海馬、黃芪、熟地黃、細辛所組成。適用于椎間盤退行性變所導(dǎo)致的頸椎病、腰椎間盤突出、椎管狹窄癥等疾病。在臨床應(yīng)用中，補腎壯督方對于改善患者局部疼痛、酸麻脹痛等神經(jīng)癥狀效果明顯[7]。

本研究通過建立大鼠椎間盤退變模型，分組給予補腎壯督方干預(yù)后，觀察miR-155-5p 及Bax、Bcl-2、Cytc 及active Caspase-3 表達差異，探討髓核細胞凋亡與以上表達差異之間的關(guān)系，以及補腎壯督方治療椎間盤退變的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8 周齡SPF 級雄性SD 大鼠100 只，購于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心（實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXK（粵）2013-0034），體重350 ± 50 g。在標準條件下進行適應(yīng)性飼養(yǎng)7天。

1.2 中藥制備

補腎壯督方配方組成如下：鹿角膠10 g、海馬5 g、黃芪30 g、熟地黃20 g、細辛4 g。（以上中藥由廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院中藥房提供）

按上述比例將飲片制成粗粉（除鹿角膠外），按上述比例將中藥混合后，加6 倍量水后浸泡30 min，武火煮沸后再文火30 min取汁；藥渣再加5倍水量，同前法煎煮，將以上兩次煎煮好的藥液均勻混合，以濾網(wǎng)濾除藥渣，將鹿角膠烊化后溶入藥液中，后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1.8 g·mL-1，常溫冷卻后，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑

水合氯醛購自國藥集團化學試劑有限公司（批號：20170305）；Tunel 試劑盒試劑盒購自羅氏制藥有限公司（批號：A0306）；Anti-Bax 抗體（批號：J3216）、Anti-Bcl-2抗體（批號：D1638）、Anti-Active Caspase-3抗體（批號：K1005），Anti-Cytochrome C（批號：G0311）抗體購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；Primers（批號：DH1203）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；HRP 羊抗鼠（批號：108623）、HRP 羊抗兔購自武漢博士德生物公司(批號：230164)；BeyoECL Plus 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號：KJ3511）；TRE-Trizol（批號：15596-026）購自賽默飛（中國）有限公司；Allin-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit（批 號：AOMD-Q050）購 自美國GeneCopoeia 公司；miRcTte miRNA Isolation Kit（批號：DP501）購自天根生化有限公司；SYBR Premix Ex Taq II（批號：GH3059）購自寶日生物技術(shù)有限公司。

1.4 主要儀器

恒溫搖床（上海博迅公司）；熒光倒置顯微鏡（德國徠卡公司）；激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）；臺式高速離心機（中科中佳公司）；半干轉(zhuǎn)膜儀、電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）；Real Time PCR 儀及凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；高速冷凍離心機（德國SIGMA公司）。

1.5 造模分組及中藥灌胃

按體重分層后，采用隨機數(shù)字表法將100 只大鼠分為五組，分別為空白對照組、模型組、低劑量中藥組、中劑量中藥組和高劑量中藥組，每組20 只。10%水合氯醛腹腔麻醉，空白對照組僅暴露椎間盤（未穿刺椎間盤）。除空白對照組外，其他組均參照崔立揚等椎間盤穿刺造模法造模[8]。術(shù)后給予8 萬單位青霉素肌注，0.2 mL/只，連續(xù)用藥3天。造模成功后，對高、中、低劑量組大鼠分別予以中藥灌胃，灌胃前將藥液置于溫水中恢復(fù)常溫后，按高、中、低劑量組分別給予1 mL、2 mL、4 mL 藥液，上下午各灌胃1 次?？瞻讓φ战M和模型組則分別予等量生理鹽水灌胃。

表1 引物名稱、序列及產(chǎn)物長度

1.6 標本采集

按上述方法中藥灌胃4 周后，每組隨機抽出10 只大鼠，腹腔注射麻醉脫頸處死后，通過原切口進入，截取L3/L4、L4/L5 腰椎及其間的椎間盤組織，生理鹽水清洗除去血液，剔除纖維環(huán)，保留髓核組織，4%中性多聚甲醛溶液固定，制作石蠟切片；部分髓核組織置凍存管內(nèi)，于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 觀察指標

1.7.1 髓核細胞凋亡率

采用TUNEL 法檢測髓核細胞凋亡率。髓核組織石蠟切片按常規(guī)方法脫蠟至水，PBS清洗，加入蛋白酶K 工作液反應(yīng)后，再加50 μL TUNEL 反應(yīng)混合液標本上，蓋玻片在暗濕盒中反應(yīng)37℃×1 h。PBS洗5 min×3，玻片上浸入2μg·mL-1DAPI 染液，DAPI 復(fù)染后，加滴熒光封片液。熒光顯微鏡下，每個樣品隨機計數(shù)5個視野，計算細胞凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%，取其平均值作為最終髓核細胞凋亡指數(shù)。

1.7.2 qRT-PCR檢測

通過實時定量PCR 技術(shù)檢測miR-155-5p 及Bax、Bcl-2、Cytc mRNA 的表達。按照試劑盒說明，完成樣品前處理及總RNA、miRNA 的提取，cDNA 合成及miRNA 反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)目的基因的種屬（大鼠），在NCBI 數(shù)據(jù)庫查詢參考核苷酸序列，采用Primer 3.0 設(shè)計引物，引物序列無非特異性擴增，應(yīng)用于實驗。反應(yīng)體系的配制，反應(yīng)參數(shù)參考試劑盒說明進行；該試驗擴增曲線和融解曲線應(yīng)用Bio-Rad CFX96 RT-PCR System 的操作方法進行。運用Bio-Rad CFX96 RTPCR 儀 配 套 的Bio-Rad CFX Manager Software1.6 數(shù)據(jù)分析軟件進行分析，且采用2^-ΔΔCt法來計算。

圖1 補腎壯督方對大鼠髓核細胞凋亡影響（原位末端轉(zhuǎn)移酶標記染色，×400）

1.7.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測

采用蛋白質(zhì)印跡法測定active Caspase-3、Bcl-2、Cytc 及Bax 表達量。采用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測。從髓核組織中提取總蛋白，使用考馬斯亮藍G250檢測蛋白質(zhì)溶液的OD值，調(diào)整樣品的蛋白濃度，完成蛋白定量。隨后依次進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗；加入按說明書稀釋好的一抗，4℃過夜。孵育后TBST洗滌5 min×3。孵育二抗：按說明書對二抗進行稀釋，室溫輕搖孵育1 h，孵育完畢TBST 洗滌5 min ×3。在暗室將雜交后印跡膜放入顯色盒中，加上顯色液，經(jīng)ECL化學發(fā)光，X光片壓片，顯影、定影、洗片，獲取目的條帶圖像，以GAPDH為內(nèi)參。

1.7.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組凋亡率水平

與空白對照組相比，模型組髓核細胞凋亡指數(shù)顯著增高（P＜0.05）。補腎壯督方灌胃干預(yù)后，高、中、低劑量中藥組髓核細胞凋亡指數(shù)較模型組均顯著降低（P＜0.05）。高、中、低劑量中藥組相互比較，中、高劑量組凋亡指數(shù)較低劑量組顯著降低（P＜0.05），中、高劑量組之間雖有差異，但無統(tǒng)計學意義。下圖1 中紅色熒光的細胞核為TUNEL 陽性結(jié)果，藍色為DAPI復(fù)染的細胞核，與空白對照組相比，髓核細胞凋亡明顯增加，從26%增加至65%；與模型組相比，低、中、高劑量組髓核細胞凋亡均有不同程度減少，從41%減少至23%。如下表2、圖1所示。

表2 各組大鼠椎間盤髓核細胞凋亡指數(shù)

2.2 qRT-PCR檢測結(jié)果

2.2.1 各組大鼠miR-155-5p表達水平比較

與空白對照組相比，模型組miR-155-5p 表達量顯著減少（P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組髓核組織中miR-155-5p 表達量顯著增加（P＜0.05）；中、高劑量組較低劑量組顯著增加（P＜0.05），中、高劑量組之間雖有差異，但無統(tǒng)計學意義。如下表3所示。

表3 各組大鼠髓核細胞miR-155-5p表達量

2.2.2 各組大鼠Bcl-2、Cytc 及Bax 在mRNA 上表達水平比較

（1）與空白對照組相比，模型組Bax 及Cytc 在mRNA 水平上表達量顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組椎間盤組織中Bax 及Cytc 在mRNA 水平上表達量顯著減少（P＜0.05）。（2）與空白組相比，模型組Bcl-2 在mRNA 水平上表達量顯著減少（P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組在mRNA 水平上表達量上Bcl-2 明顯增加（P＜0.05）；見下表4。

表4 各組大鼠髓核組織Bcl-2、Cytc及Bax mRNA表達量

2.3 Western blot檢測結(jié)果

與空白組相比，模型組active Caspase-3、Bax 及Cytc 表達量顯著增加（P＜0.05），Bax/Bcl-2 比值顯著增加（P＜0.05），而Bcl-2 表達量顯著減少（P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組椎間盤組織中active Caspase-3、Bax 及Cytc 顯著減少（P＜0.05），Bax/Bcl-2比值增加（P＜0.05）顯著減少，而模型組Bcl-2 表達量顯著增加（P＜0.05）；active Caspase-3、Bax 及Cytc 在高劑量組較低、中劑量組顯著減少（P＜0.05），低、中劑量組之間雖有差異，但無統(tǒng)計學意義；Bcl-2 在高劑量組較低、中劑量組顯著增加（P＜0.05），低、中劑量組之間雖有差異，但無統(tǒng)計學意義；Bax/Bcl-2 比值增加（P＜0.05）在低、中、高三個劑量組間均有顯著差異（P＜0.05）。見下表5，表6及圖2。

表5 各組大鼠髓核組織active Caspase-3及Cytc蛋白表達量

表6 各組大鼠髓核組織Bcl-2、Bax蛋白表達量及Bax/Bcl-2比值

圖2 大鼠Active caspase-3、Bcl-2、Bax及Cytc蛋白表達量

3 討論

椎間盤是一種由纖維和軟骨所構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，其主要作用是在椎體間傳導(dǎo)壓力和吸收震蕩。由于其內(nèi)無血管分布，僅僅依靠組織間的彌散作用來供給營養(yǎng)，加上脊柱負重等因素，從而導(dǎo)致其極易發(fā)生退化[9]。在椎間盤退變過程中，由細胞凋亡所介導(dǎo)的髓核細胞減少起到關(guān)鍵性作用[2]。隨著髓核細胞的大量凋亡，其所合成的蛋白多糖及Ⅱ型膠原減少，使得髓核作為“壓力吸收器”的功能大大減弱，進而導(dǎo)致了椎間盤退變的發(fā)生。本實驗中通過TUNEL 法檢測大鼠退變椎間盤髓核組織中髓核細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)大鼠模型組椎間盤組織內(nèi)髓核細胞凋亡指數(shù)較空白對照組顯著增加，中藥灌胃后檢測發(fā)現(xiàn)髓核細胞凋亡指數(shù)較模型組不同程度顯著減少，這一發(fā)現(xiàn)表明在椎間盤退變過程中髓核細胞凋亡發(fā)揮了重要作用，補腎壯督方對于抑制髓核細胞凋亡，改善椎間盤退變有顯著作用。

miRNA 廣泛存在于病毒和真核生物體內(nèi)，在生物體生長、發(fā)育、繁殖和疾病發(fā)生等過程中發(fā)揮著重要作用[10]。miRNA 在調(diào)節(jié)蛋白表達過程中通過互補或不完全互補的方式與基因mRNA 相應(yīng)區(qū)域靶向結(jié)合，可沉默或抑制靶基因的表達[11]。李濤等[12]通過人結(jié)腸癌細胞體外培養(yǎng)及qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)miR-155 較癌旁組織升高，抑制miR-155 表達后，細胞凋亡率增高，線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白Bcl-2 及Cytc 同時增高。Wang 等[13]研究發(fā)現(xiàn)在人髓核細胞中miR-155 可靶向調(diào)控FADD 及active Caspase-3，抑制miR-155表達時，F(xiàn)ADD 及active Caspase-3 則過表達，導(dǎo)致髓核細胞凋亡。active Caspase-3 是miR-155 的靶蛋白，通過上調(diào)miR-155 可導(dǎo)致active Caspase-3 下調(diào)，而下調(diào)miR-155 則引起active Caspase-3 過表達。本實驗通過qRT-PCR 檢測顯示，miR-155-5p 模型組表達量較空白對照組顯著降低，補腎壯督方灌胃后其表達量較模型組顯著增高。這表明miR-155-5p 可能參與髓核細胞凋亡的線粒體凋亡通路，并在退變的髓核組織中呈低表達。

在哺乳動物中，線粒體是調(diào)節(jié)大部分凋亡通路的主要細胞器，其細胞凋亡的調(diào)控中心。研究表明，線粒體凋亡通路在髓核細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用[13]。細胞內(nèi)部損傷或在應(yīng)激條件下，上游信號分子作用于線粒體膜，Bcl-2 蛋白家族活化形成蛋白孔道，線粒體PT 孔開放，凋亡活性物質(zhì)（如Cytc 等）釋放，引起下游Caspase-9 活化，并進一步激活active Caspase-3，促使細胞發(fā)生不可逆的凋亡。Bcl-2 蛋白家族可以調(diào)控線粒體膜通道的開放以及凋亡相關(guān)物質(zhì)的流動，是線粒體凋亡通路中關(guān)鍵分子[4]。其家族成員按照功能可以分為兩大類：抑制凋亡家族成員（如Bcl-2）以及促進凋亡家族成員（如Bax）。其中Bcl-2 能穩(wěn)定線粒體膜功能阻止其釋放Cytc及Caspase 家族蛋白，而Bax可促進線粒體跨膜電位下降，引起Cytc 的釋放，進而引發(fā)凋亡[15-16]。Bax/Bcl-2 比值預(yù)示著細胞走向凋亡或存活，其比值有增高趨勢則細胞趨向凋亡，下降趨勢則趨向存活；本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在基因表達方面，Cytc mRNA、Active Caspase-3 mRNA、Bax mRNA 表達模型組較空白對照組顯著增加（P＜0.05），Bcl-2 mRNA 則顯著減少（P＜0.05）；補腎壯督方灌胃干預(yù)后，Cytc mRNA、Active Caspase-3 mRNA、Bax mRNA 表達中藥組（低、中、高）較模型組顯著減少（P＜0.05），Bcl-2 mRNA 則顯著增加。在蛋白表達方面，Cytc、active Caspase-3、Bax 蛋白表達模型組較空白對照組顯著增加（P＜0.05），Bcl-2 則顯著減少（P＜0.05），Bax/Bcl-2比值顯著增加（P＜0.05）；中藥干預(yù)后，Cytc、active Caspase-3、Bax 蛋白表達中藥組（低、中、高）較模型組顯著減少（P＜0.05），Bcl-2 則顯著增加（P＜0.05），Bax/Bcl-2 比值顯著減?。≒＜0.05）；由此我們推測線粒體通路所導(dǎo)致的髓核細胞凋亡參與了椎間盤退變過程，補腎壯督方可減少髓核細胞凋亡進而改善椎間盤退變。

中醫(yī)中雖無“椎間盤退行性變”一說，但是根據(jù)其臨床表現(xiàn)，將其歸屬于“痹癥”范疇。本課題組在長期臨床中，總結(jié)經(jīng)驗認為其病機總屬“督脈氣衰、陽氣不振”，并擬補腎壯督方以“溫養(yǎng)督脈”為治則，方中以鹿角膠及海馬為君藥，以補腎壯督，通陽化氣；黃芪、熟地為臣藥，以滋陰合陽，補氣行血；佐以細辛，以通絡(luò)化痰，行氣止痛[7,17]。在前期實驗過程中發(fā)現(xiàn)該方可提高椎間盤退變大鼠椎間盤ATP 酶活性，保護線粒體的生理功能，延緩大鼠腰椎間盤退變[18]。

綜上所述，椎間盤退變大鼠造模成功后經(jīng)補腎壯督方干預(yù)，髓核細胞凋亡率顯著減少，Active Caspase-3、Cytc 和Bax mRNA 及蛋白表達均明顯下降，而miR-155-5p、Bcl-2 mRNA 及蛋白表達明顯增加，由此推斷補腎壯督方的機制可能通過減少Active Caspase-3、Cytc 和Bax 表達，增加Bcl-2 蛋白表達，抑制線粒體通路所導(dǎo)致的髓核細胞凋亡，從而改善椎間盤退行性變。miR-155與線粒體凋亡通路之間的關(guān)系尚需進一步研究以闡明。