一株降解苯酚蘆葦內(nèi)生菌的分離與鑒定

王清東 李玉璽 王乙羽 劉慧敏 劉俊華 張孝霖

摘 要：為得到高效苯酚降解菌，以黃河三角洲鹽堿地生蘆葦（Phragmites australis）為材料，分離出1株能降解苯酚的蘆葦內(nèi)生菌L12，該菌能在以苯酚為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長。采用4-氨基安替比林分光光度法測苯酚降解率，對該菌株的形態(tài)特征、理化性質(zhì)、16S rDNA基因序列進(jìn)行研究。結(jié)果表明：該菌株呈桿狀，革蘭氏染色呈陰性，初步鑒定為假單胞菌（Pseudmonas sp），能有效降解苯酚。

關(guān)鍵詞：苯酚降解菌;蘆葦;假單孢桿菌;理化性質(zhì)

中圖分類號 Q93-331文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）14-0040-03

Abstract：In order to obtain a hyper efficient phenol-degrading bacterium strain， Phragmites australis in saline-alkali soil of the Yellow River Delta was used as the material to isolate a Phragmites australis endophytic bacteria L12， which was able to degrade phenol. The bacteria can survive on the medium with phenol as the sole carbon source. Phenol degradation rate was measured by 4-aminoantipyrine spectrophotometry. Further studies involving morphological characteristics， physicochemical properties and 16S rDNA gene sequence showed that the strain was rod-shaped and Gram-negative. Its then identified as Pseudmonas sp. The results showed that a Pseudomonas endophyte was obtained from reed， which can degrade phenol effectively.

Key words：Phenol degrading bacteria; Phragmites australis; Pseudmonas sp; Physicochemical properties

近年來，苯酚等酚類化合物在農(nóng)藥、造紙和醫(yī)藥等眾多行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[1，2]，但苯酚對許多生物體具有較強(qiáng)的毒害作用，已被許多國家列入重點污染物名單[3-5]。含有大量苯酚類污染物的污水被排入河流和土壤中，嚴(yán)重污染環(huán)境，危害人類健康，因此，消除苯酚類污染物的毒害作用對有效保護(hù)環(huán)境和人體健康具有重要意義。目前，清除工業(yè)廢水中苯酚的方法主要有物理法、化學(xué)法及生物法。生物法主要是利用微生物的新陳代謝將苯酚類污染物轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)，與物理和化學(xué)法相比，具有經(jīng)濟(jì)高效的特點，尤其是可以實現(xiàn)無害化處理，并且處理量較大，沒有二次污染，而微生物自身種類繁多、適應(yīng)強(qiáng)、潛能大，因此生物法是國內(nèi)含酚廢水無害化處理的首選方法[6，7]。雖然國內(nèi)外對含酚廢水的生物處理已有廣泛研究，但仍不能滿足工業(yè)應(yīng)用和環(huán)境保護(hù)中的各種需求。筆者以黃河三角洲鹽堿地生蘆葦為研究對象，從中篩選出具有較強(qiáng)降解苯酚類污染物能力的菌株L12，為以后生物降解苯酚、降低環(huán)境中的苯酚類污染物提供參考，并對擴(kuò)充苯酚降解菌的菌種資源庫有實際應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及試劑 試驗樣品為黃河三角洲鹽堿地生蘆葦，所用試劑與富集培養(yǎng)基、初篩培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基等均參考姜立春[8]、劉桂萍等[9]的實驗。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱、超凈工作臺、紫外分光光度計、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 用取樣鏟挖取黃河三角洲（38°14′5.8″N，117°49′2.22″E）鹽堿地生蘆葦放入冷藏式采樣樣品保存箱，帶回實驗室立即進(jìn)行菌株的分離篩選。

1.2.2 菌種分離 （1）取蘆葦?shù)那o段用自來水沖洗，晾干后蒸餾水沖洗3次，將其浸泡在75%乙醇中1min，后用無菌水漂洗3次，再用0.1%次氯酸進(jìn)行消毒后，用無菌水漂洗3次，取最后1次沖洗的無菌水100μL，涂布于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，檢驗植株表面消毒是否完全。將表面消毒的植株切掉兩端露出新組織，再接種于PDA平板28℃恒溫靜置培養(yǎng)5h。待培養(yǎng)基上有可見菌落時，挑取菌落分離純化，保存單菌落備用。

（2）菌懸液的制備（濕重法）：用接種環(huán)分別挑取初篩平板上的單菌落，接種到裝有100mL種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30℃、160r/min搖床培養(yǎng)48h。8500r/min離心10min，棄上清液，重復(fù)3次，稱濕重，用發(fā)酵培養(yǎng)基配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的菌懸液。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)：按照1%的接種量，將各菌株菌懸液接種到裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的150mL錐形瓶中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)48h。

（4）酚含量的測定：采用國家環(huán)?？偩炙|(zhì)揮發(fā)性酚的測定方法，向各發(fā)酵液中依次加入0.25mL 20%氨性氯化銨緩沖液、0.5mL 2% 4-氨基安替比林溶液、0.5mL 8%鐵氰化鉀溶液，混合，放置10min后測其OD510，計算出苯酚降解率，選取苯酚降解率最高的菌株作為篩選的目的菌株。

1.2.3 苯酚降解菌鑒定 （1）菌落形態(tài)學(xué)：觀察平板上菌落的形態(tài)特征（顏色、質(zhì)地、表面狀況、邊緣狀況、形狀、隆起程度），并對其進(jìn)行革蘭氏染色[10]。（2）菌落分子鑒定[7，11]：細(xì)菌基因組DNA提取根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，采用細(xì)菌通用引物27F（5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3）及1492R（5-GGTTACCTT GTTACGACTT-3）進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，根據(jù)所測得序列，將其序列通過NCBI進(jìn)行BLAST對比分析，并利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。（3）理化性質(zhì)：挑取相應(yīng)菌株到相應(yīng)平板或發(fā)酵液中，進(jìn)行淀粉水解實驗、甲基紅試驗、V-P反應(yīng)、檸檬酸鹽利用試驗、吲哚試驗、過氧化氫試驗、油脂水解實驗、明膠液化實驗、糖發(fā)酵實驗[10，12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 具苯酚降解能力菌株的篩選結(jié)果 樣品經(jīng)初篩之后，得到6株具有苯酚降解能力的菌株，分別命名為L7～L12，對其分別進(jìn)行復(fù)篩培養(yǎng)之后，測得其苯酚降解率如圖1所示。由圖1可知，在相同培養(yǎng)條件下，6株菌株的苯酚降解率在81%～92%，其中L10的苯酚降解率最低（81.72%），L12的降解率最高（92.25%），所以將L12作為本次實驗的目的菌株。

2.2 苯酚降解菌的理化性質(zhì) 觀察苯酚降解菌的菌落特征，可以看出菌落較粘稠、隆起，菌落邊緣與中央部位顏色一致，邊緣整齊，菌落呈乳白色、圓形，革蘭氏染色呈陰性。通過一系列理化實驗對L12菌株進(jìn)行了初步鑒定，理化實驗結(jié)果如表1所示。

2.3 苯酚降解菌的分子生物學(xué)鑒定 將菌株提取基因組DNA后，通過細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后所得的產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）股份測序后，通過與NCBI進(jìn)行BLAST對比分析，結(jié)果表明該菌株與假單胞菌（Pseudmonas sp）有極高的相似度，初步鑒定此菌株為假單胞菌，并利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定其進(jìn)化地位，結(jié)果如圖2所示。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，從蘆葦內(nèi)生菌中分離出1株細(xì)菌，該菌株呈桿狀，革蘭氏染色呈陰性，初步鑒定為假單胞菌。植物對苯酚等有害化學(xué)物質(zhì)的修復(fù)主要有賴于協(xié)同功能微生物的數(shù)量和活性，其中細(xì)菌是發(fā)揮最主要作用的微生物類群。從植物中分離、篩選內(nèi)生降解苯酚的細(xì)菌并研究其特性，對于揭示植物降解苯酚等有害化學(xué)物質(zhì)過程中微生物所扮演的生態(tài)角色具有重要意義。

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（責(zé)編：徐世紅）