脂肪氧化酶對玉米種子有關(guān)特性的影響

沈慶榮

摘 要：以玉米親本565、409、410及其雜種后代409×565、410×565為材料，對自然越夏條件下玉米種子有關(guān)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：（1）根據(jù)Lox-1、Lox-2同時缺失的材料較耐儲藏的研究結(jié)果，玉米親本565屬不耐儲藏材料，親本409、410及其雜種后代409×565和410×565屬相對較耐儲藏材料;（2）玉米雜種后代的Lox缺失∶不缺失≈1∶2，控制玉米耐儲藏的脂肪氧化酶缺失為隱性遺傳;（3）耐儲藏材料（親本409、410、雜種后代409×565和410×565）的發(fā)芽率和淀粉酶活性均顯著高于不耐儲藏親本565高出很多，而MDA含量和脫氫酶活性則表現(xiàn)相反。

關(guān)鍵詞：玉米;脂肪氧化酶;種子性狀;影響

中圖分類號 S513;O629.8文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）14-0028-03

作物種子是人類繁衍、生存和發(fā)展最根本的物質(zhì)基礎(chǔ)。種子的妥善保存為我國作物育種、生物工程及21世紀(jì)實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供了重要的物質(zhì)保障[1]。玉米作為我國主要糧食作物，種植面積大，產(chǎn)量接近我國糧食總產(chǎn)量的1/3。但是玉米耐儲藏性差，一旦儲藏條件不適宜，極易陳化。種子陳化變質(zhì)的機(jī)理眾說紛呈，其中脂質(zhì)過氧化被公認(rèn)為是導(dǎo)致種子陳化變質(zhì)的最主要因素，而脂肪氧化酶是脂質(zhì)降解的關(guān)鍵酶[2]。

脂肪氧化酶是一種含非血紅素鐵的蛋白質(zhì)[3]，專一催化具有順順—戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸的加氧反應(yīng)，氧化生成共軛雙鍵的氫過氧化物，其反應(yīng)底物主要有亞油酸、亞麻酸及花生四烯酸等游離多元不飽和脂肪酸。脂肪氧化酶的同功酶主要有3種，分別為Lox-1、Lox-2、Lox-3，目前在水稻上存在并且在水稻耐儲藏性、抗蟲性等方面的作用均已得到了驗(yàn)證[2-4]。脂肪氧化酶的缺失可以中斷脂質(zhì)的氧化反應(yīng)，減輕谷物的氧化變質(zhì)，使谷物儲藏不會因陳化變質(zhì)作用而降低品質(zhì)，保持谷物的清新氣味。而玉米的脂肪含量通常在4%左右，極易酸敗變質(zhì)或遭病蟲侵害，每年因陳化變質(zhì)造成的損失高達(dá)數(shù)百億元。脂質(zhì)的降解是導(dǎo)致谷物儲藏期間品質(zhì)變劣、產(chǎn)生陳味的根源。筆者以玉米親本565、409、410及其雜種后代409×565、410×565為材料，在自然越夏條件下對玉米種子的特性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)材料由安徽科技學(xué)院玉米研究所提供，分別為玉米親本565、409、410及其雜種后代409×565、410×565。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 在自然條件下將玉米種子越夏儲藏，試驗(yàn)時間設(shè)定在2018年10月。

1.2.2 脂肪氧化酶缺失測定 玉米取胚1粒（單粒測定），加入檢測液2mL研磨，然后4000r/min離心10min，取上清液1mL倒入比色管，加入指示液3mL，放置4～30h（不同的同工酶顯色時間不一致）后比色（對照上清液80℃水浴30min）。

1.2.3 不同老化處理時間發(fā)芽指標(biāo)的測定 按照GB/T3543.4—1995技術(shù)規(guī)定[4]進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)，測定發(fā)芽率。選取直徑1mm的沙礫作發(fā)芽床。將沙清洗消毒，取直徑150mm的培養(yǎng)皿作發(fā)芽容器。先在培養(yǎng)皿中鋪0.5cm厚沙，每個培養(yǎng)皿播50粒種子并覆1.5cm厚沙。沙子含水量在60%～80%（即100g干沙中加8～26mL水）。加蓋培養(yǎng)皿蓋，3次重復(fù)，然后置于發(fā)芽室中弱光條件下25℃、相對濕度80%恒溫恒濕培養(yǎng)。當(dāng)幼苗長至1cm左右時取下培養(yǎng)皿蓋，然后每天定時用噴霧器補(bǔ)水1次，保持苗床含水量在60%～80%。

1.2.4 淀粉酶活性測定 根據(jù)《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》（王學(xué)奎主編，第2版）中的淀粉酶活性測定方法[5]進(jìn)行測定計(jì)算，在540nm波長下比色，按式（1）計(jì)算：

式中：X為表上查得的麥芽糖含量（mg），VT為淀粉酶原液總體積（mL），VS為測定時取得酶液體積，W為樣品質(zhì)量，t為反應(yīng)時間（min），N為樣品稀釋倍數(shù)。

1.2.5 丙二醛（MDA）含量測定 稱取0.5g玉米葉，加5%三氯乙酸（TCA）5mL，研磨后所得勻漿在3000r/min離心10min。取上清液2mL，加0.67%硫代巴比妥酸（TBA）2mL，混合后在100℃水浴30min，冷卻后再離心1次。分別測定上清液在450、532和600nm處的吸光度值，并按式（2）算出MDA濃度C（μmol/L），參照文獻(xiàn)[6]方法測定。

式中：C為丙二醛的濃度，A450、A532、A600分別代表450、532和600nm波長下的吸光度值。

1.2.6 脫氫酶活性測定 參照胡晉（1986）TTC改進(jìn)法[7]，將老化玉米種子萌發(fā)1d，剝下胚，每個樣品10個完整胚，加入新鮮0.1% TTC溶液10mL搖勻，蓋上塞子，置35℃溫箱（黑暗）中染色3h，終止反應(yīng)后蒸餾水沖洗3次，取出濾干后移入試管中，加入10mL 95%酒精于35℃溫箱中浸提24h。測定490nm下的OD值

2 結(jié)果與分析

2.1 不同玉米親本材料的耐儲藏性 玉米中含有多種酶，其中脂肪氧化酶主要催化不飽和脂肪酸中含雙順式1，4—戊二烯結(jié)構(gòu)。通過加入分子氧，生成各種過氧化物，直接影響玉米種子質(zhì)量。前期研究表明：Lox-1，Lox-2同時缺失時材料較耐儲藏，否則不耐儲藏;Lox-3影響蟲蝕率。由表1可以看出，親本565的Lox-1、Lox-2表現(xiàn)不缺失，Lox-3表現(xiàn)缺失，可以判定屬不耐儲藏材料;親本409和410表現(xiàn)一致，Lox-1、Lox-2同時缺失，Lox-3不缺失，屬耐儲藏品種。

2.2 不同玉米雜種后代脂肪氧化酶的遺傳規(guī)律 脂肪氧化酶存在于多種禾本科植物中，其中自花授粉作物大豆、水稻脂肪氧化酶含有3種（Lox-1、Lox-2、Lox-3），分別由1對基因控制。3種同工酶存在分別由單個顯性基因控制，而3種同工酶缺失分別由3個隱性等位基因控制[8]。由表2可以看出，脂肪氧化酶缺失試驗(yàn)測定結(jié)果顯示，雜種后代409×565和410×565的Lox缺失∶不缺失≈1∶2，這可能是由于試驗(yàn)測定的群體較小以及玉米是異花授粉作物所造成的;其不同位點(diǎn)的缺失與否，是在不同波長的OD值與其對照相比較得出的（其中Lox-1、Lox-2是在432nm下比較得出的，Lox-3是在534nm下比較得出的）。由此可見，玉米脂肪氧化酶缺失屬于一種隱性遺傳。

2.3 不同玉米親本及雜種后代的生化指標(biāo)

2.3.1 發(fā)芽率 玉米在儲藏過程中，內(nèi)部會發(fā)生各種生理生化反應(yīng)，進(jìn)而影響其發(fā)芽率。發(fā)芽率的變化也反映了玉米在儲藏過程中對逆境的抵抗能力，進(jìn)一步反映了玉米能否耐儲藏的生理特性。由表3可以看出，經(jīng)過自然越夏儲藏后，玉米親本409、410、雜種后代409×565和410×565的發(fā)芽率高達(dá)78.3%、80.2%、77.2%和79.4%，不耐儲藏的親本565只有71.8%。耐儲藏材料發(fā)芽率明顯高于不耐儲藏材料，結(jié)合2.2研究結(jié)果可以判斷雜種后代409×565和410×565的儲藏特性屬較耐儲藏。

2.3.2 淀粉酶活性 淀粉酶能夠產(chǎn)生還原性糖，淀粉酶活性的大小與產(chǎn)生的還原糖量成正比，可用麥芽糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用比色法測定淀粉酶生成的還原糖量，以單位質(zhì)量的樣品在一定時間內(nèi)生成的還原糖量表示酶活力[5]。玉米種子的淀粉酶活力決定了種子活力，進(jìn)而決定其耐儲藏特性。由表3可知，經(jīng)過自然越夏儲藏后，玉米親本409、410、雜種后代409×565和410×565的淀粉酶活性要比親本565高得多，耐儲藏材料的淀粉酶活性約為不耐儲藏材料的5～6倍。

2.3.3 丙二醛含量 玉米種子在儲藏過程中，膜質(zhì)由于過氧化作用會導(dǎo)致其完整性遭到破壞[9]，導(dǎo)致電解質(zhì)外滲。通過測定MDA含量可以衡量膜質(zhì)過氧化水平。由表3可知，相對不耐儲藏的親本565而言，耐儲藏的親本材料409、410及雜種后代409×565和410×565的MDA含量很少，約為親本565的1/3～1/2。由此可知，經(jīng)過自然越夏后，耐儲藏材料的膜質(zhì)破壞程度較小，細(xì)胞物質(zhì)外滲較少，膜受到的傷害較輕。

2.3.4 脫氫酶活性 脫氫酶活性是測定種子活力的重要指標(biāo)，脫氫酶能準(zhǔn)確快速地反映種子胚細(xì)胞的還原能力。氧化態(tài)的氯化三苯基四氮唑（TTC）接受了活種子呼吸過程中脫氫酶產(chǎn)生的氫，變成還原態(tài)的紅色三苯基甲臜（TTC）。提取后定量測定，TTC含量愈高，脫氫酶活性愈強(qiáng)，種子活力愈高[9]。玉米種子是典型的淀粉性種子，活力很高，脫氫酶活性也很高。由表3可知，不耐儲藏的材料親本565的脫氫酶活性要比其他2份自交系和2份雜交種高出0.254～0.272個單位。種子活力的高低直接決定了儲藏過程中的生理變化，活力越高則儲藏越困難。由此可知，雜種后代409×565、410×565的儲藏安全性相對較高。

3 結(jié)論與討論

種子在儲藏過程中會逐漸老化并最終喪失發(fā)芽能力，種子陳化是自然界的普遍現(xiàn)象，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的嚴(yán)重問題。本研究發(fā)現(xiàn)，Lox-1、Lox-2同時缺失的材料在儲藏過程中具有較好的抗逆性，相對較耐儲藏;耐儲藏的親本409、410、雜種后代409×565和410×565的發(fā)芽率和淀粉酶活性顯著高于不耐儲藏親本565，而MDA含量和脫氫酶活性則表現(xiàn)相反;玉米雜種后代的Lox缺失∶不缺失≈1∶2，屬隱性遺傳，這與自花授粉作物水稻、大豆的研究結(jié)論相一致。但是玉米作為異花授粉作物，其種子基因純合具有一定難度，而且品種間也存在較大差異，難以找到高度純合的材料。前期研究結(jié)果也表明，不同的參試品種或品系種子存在較大差異，主要可能與玉米種子的純合度有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]陳新雄，陳小玲，陳叔平.低溫庫種質(zhì)安全保存理論研究的進(jìn)展[J].植物遺傳資源科學(xué)，2001（2）：54-58.

[2]Wilson D O，McDonald M B.Tlipid eroxidation model of seed deterioration[J].Seed Science and Technology， 1986（14）：259-268.

[3]Loiseau J，Vu B L，Macherel M H，et al.Seed lipoxygenases：occurrence and functions[J].Seed Science Research， 2001（11）：199-211.

[4]畢辛華，戴心維.種子學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：49，81-82，88.

[5] 王學(xué)奎.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].第2版.北京：高等教育出版社，2006.

[6]李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，1999.

[7]Hu J . Improvement of seed activity measurement-TTC quantitative method[J].Seed，1986（5-6）：71-72.

[8]吳躍進(jìn)，吳敬德，張瑛，等.一種作物脂肪氧化酶同工酶快速檢測技術(shù)[P].中華人民共和國知識產(chǎn)權(quán)（發(fā)明專利公報），2001，17（21）：53.

[9]Bewly，J. D. Black. M. Seeds. Physiology of Development Germinition[M]. New York，U.S.A.，1985.

（責(zé)編：徐世紅）