基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討仙靈骨葆膠囊治療骨質(zhì)疏松癥的作用機制

綦向軍 陳國銘 史佩玉 張兆萍 方彩珊 鄭深建 邢萬里 黎健敏 周潤吉 徐福平

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 5104052.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)院治未病中心，廣東 廣州 510120

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是臨床常見的全身性骨骼疾病之一，以骨量降低，骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，骨脆性增加為特征，以致骨折易于發(fā)生[1]。骨質(zhì)疏松癥是一種年齡相關(guān)性疾病，隨著人口老齡化的進展，OP發(fā)病率逐漸升高，早期流行病學(xué)調(diào)查顯示：我國50歲以上女性O(shè)P發(fā)病率為20.7%，男性為14.4%；60歲以上人群患病率明顯增高[2]。據(jù)2015年預(yù)測，我國在未來20年、40年間用于骨質(zhì)疏松癥的費用分別高達1 320億元、1 630億元[3]。因此，OP儼然成為我國嚴重的公共衛(wèi)生問題，預(yù)防以及早期治療具有重要的臨床意義。

仙靈骨葆膠囊是根據(jù)苗族驗方研制而成的成方制劑，全方由淫羊藿、續(xù)斷、補骨脂、地黃、丹參、知母6味中藥組成，具有滋補肝腎、強筋壯骨的功效，目前廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥、骨折、骨關(guān)節(jié)炎等疾病[4]，而在OP的運用方面尤為突出。王桂倩等[5]對仙靈骨葆膠囊治療原發(fā)性O(shè)P的隨機對照試驗進行Meta分析后表明，仙靈骨葆膠囊單用或與其他西藥聯(lián)合使用，在治療骨質(zhì)疏松癥方面的療效優(yōu)于單用西藥治療；安一方等[6]對仙靈骨葆膠囊治療絕經(jīng)后OP的隨機對照試驗進行Meta分析后表明仙靈骨葆膠囊在改善腰椎骨密度、提高臨床有效率及改善疼痛方面療效確切；章秩立等[7]通過對仙靈骨葆膠囊安全性進行系統(tǒng)評價，認為其總體安全性可接受。故宏觀上已有大量的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明仙靈骨葆運用于OP具有較好的療效和安全性，但對于其微觀藥理作用機制尚缺乏全面、系統(tǒng)的闡述，而傳統(tǒng)藥理學(xué)為證明藥物與疾病的關(guān)系時，常常通過設(shè)置對照實驗、控制藥物變量，研究其對疾病靶蛋白的親和力、特異性以揭示藥物對疾病的起效機制[8]，與中藥“多組分、多靶點、多通路”的機制特點不符。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念最初由Hopkins[9]提出，相較于傳統(tǒng)藥理學(xué)相比，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)更加注重多組分、多靶點、多通路的協(xié)同作用，與中藥的特點相符，目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥作用機制研究、新藥挖掘、老藥新用等方面廣泛運用[10]。本研究擬運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法進行探究。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

本研究所運用的數(shù)據(jù)庫及軟件如下：①中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[11]；②中藥綜合數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicine Information Database，TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid/)[12]；③Cytoscape3.7.1軟件；④STRING數(shù)據(jù)分析平臺(https://string-db.org/)[13]；⑤GeneCards: The Human Gene Database(https://www.genecards.org/)[14]；⑥D(zhuǎn)AVID數(shù)據(jù)分析平臺(https：//david.ncifcrf.gov/)[15]。

1.2 仙靈骨葆膠囊活性成分及其靶標(biāo)的獲取

TCMSP中收錄了500多種中藥以及30 069個中藥化合物，TCMID中收錄了8 159味中藥以及25 210種中藥化合物，運用TCMSP、TCMID分別檢索淫羊藿、續(xù)斷、補骨脂、地黃、丹參、知母，獲取相應(yīng)的藥效成分。將口服利用度(oral bio-availability，OB)設(shè)置為≥30%，類藥性(drug likeness，DL)設(shè)置為≥0.18進行活性成分篩選，并運用TCMSP查找成分所對應(yīng)的靶點信息，將所得數(shù)據(jù)去重后輸入STRING數(shù)據(jù)分析平臺獲取靶點的標(biāo)準基因名稱。

1.3 仙靈骨葆“活性成分-作用靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運用Cytoscape 3.7.1軟件繪制“活性成分-作用靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖。將上述活性成分及靶標(biāo)信息導(dǎo)入軟件，根據(jù)軟件所提供的“network analyzer”功能進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，以靶點度值(degree)和中介中心度(betweenness centrality)評價仙靈骨葆核心成分以及靶點[13]。

1.4 蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將所得靶標(biāo)信息上傳至STRING數(shù)據(jù)分析平臺，數(shù)據(jù)分析模式設(shè)定為“Multiple proteins”，物種限制為“Homo sapiens”，提取靶點所對應(yīng)的基因信息。對數(shù)據(jù)進行預(yù)讀后將置信度設(shè)置為≥0.98，并將孤立蛋白進行隱藏，最后輸出PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖(protein-protein interaction network，PPI network)。

1.5 骨質(zhì)疏松癥靶標(biāo)基因的獲取

以“osteoporosis”為關(guān)鍵詞從GeneCards: The Human Gene Database獲取骨質(zhì)疏松癥疾病基因，與仙靈骨葆靶點基因?qū)Ρ群蠛Y選出仙靈骨葆治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)聯(lián)基因數(shù)據(jù)。

1.6 KEGG通路富集以及GO生物過程富集分析

將仙靈骨葆治療骨質(zhì)疏松癥的靶點基因上傳至DAVID數(shù)據(jù)分析平臺進行KEGG通路富集以及GO生物過程富集分析，分析時將物種限定為“Homo sapiens”。提取P<0.05的通路以及生物過程，運用Cytoscape 3.7.1軟件繪制仙靈骨葆治療骨質(zhì)疏松癥的“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 仙靈骨葆活性成分的篩選以及相應(yīng)作用靶標(biāo)的獲取

以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選條件，共獲得活性成分115種，其中淫羊藿23種，續(xù)斷8種，熟地黃2種，丹參65種，知母15種，補骨脂2種。詳見表1。

表1 核心活性成分及靶標(biāo)Table 1 The core active components and targets

2.2 仙靈骨葆“活性成分-作用靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖

運用Cytoscape 3.7.1軟件繪制仙靈骨葆“活性成分-作用靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖1。網(wǎng)絡(luò)圖中藍色圓形節(jié)點為作用靶標(biāo)，黃色多邊形節(jié)點為活性成分，線條代表活性成分與靶標(biāo)具有對應(yīng)關(guān)系，共計396個節(jié)點，其中活性成分節(jié)點95個，靶標(biāo)節(jié)點301個，MOL009317、MOL008188、MOL009322等20個化合物未查詢到對應(yīng)的靶標(biāo)節(jié)點，故未納入到網(wǎng)絡(luò)圖中。節(jié)點的Degree值代表網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點進行連接的線條數(shù)。將其網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析結(jié)果導(dǎo)出后示：平均節(jié)點度值為8.187 817 259，大于該度值的節(jié)點共有96個，平均中介中心度為0.005 437 999，大于平均中介中心度的節(jié)點有52個。節(jié)點所對應(yīng)的節(jié)點度值以及中介中心度越高表明所對應(yīng)的活性成分或靶點越可能是網(wǎng)絡(luò)圖的核心，可作為對仙靈骨葆治療骨質(zhì)疏松癥的機制預(yù)測依據(jù)。Degree值及中介中心度均大于平均值的活性成分及靶標(biāo)按照Degree進行降序排列后詳見表1。

圖1 仙靈骨葆“活性成分-作用靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 The active component-target network of XianlingGubao Capsule

2.3 仙靈骨葆治療骨質(zhì)疏松癥的交集基因篩選

將活性成分作用靶點轉(zhuǎn)化為基因信息后與骨質(zhì)疏松癥疾病相關(guān)基因進行對比后共篩得交集基因143個。詳見表2。

表2 仙靈骨葆治療骨質(zhì)疏松癥交集基因Table 2 The related genes of XianlingGubao Capsule in treating osteoporosis

2.4 仙靈骨葆PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運用STRING數(shù)據(jù)平臺對仙靈骨葆進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，設(shè)置置信度≥0.98，并且隱藏孤立蛋白后得到仙靈骨葆PPI網(wǎng)絡(luò)圖，共得到111種蛋白之間的互作關(guān)系，詳見圖2，圖中圓形節(jié)點代表靶蛋白，蛋白之間線條的顏色代表蛋白之間不同的作用關(guān)系，詳見圖3。所得PPI網(wǎng)絡(luò)圖平均節(jié)點度值為4.145 454 545，大于該度值的節(jié)點共有34個，平均中介中心度為0.022 127 656，大于平均中介中心度的節(jié)點有20個。Degree值及中介中心度均大于平均值的活性成分及靶點詳見表3。

表3 PPI核心靶標(biāo)蛋白Table 3 The core target proteins in PPI

圖2 仙靈骨葆PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The PPI network of XianlingGubao Capsule

圖3 蛋白互作關(guān)系注釋圖Fig.3 The annotation of PPI network注：known interactions：已知的相互作用關(guān)系；from curated databases：數(shù)據(jù)庫獲??；experimentally determined：實驗驗證；predicted interaction：預(yù)測的相互作用關(guān)系；gene neighborhood：基因鄰域；gene fusions：基因融合；gene co-occurrence：基因共現(xiàn)；others：其他；textmining：文本挖掘；co-expression：共表達；protein homology：同源蛋白

2.5 GO生物過程富集以及KEGG通路富集

運用David數(shù)據(jù)分析平臺對仙靈骨葆治療骨質(zhì)疏松癥關(guān)聯(lián)基因進行GO生物過程富集以及KEGG通路富集。分別計算相應(yīng)富集結(jié)果的P值(采用Bonferroni法進行校正，P<0.05時富集顯著)，并提取具有意義的富集結(jié)果。GO生物過程富集共獲得612項，僅取富集基因數(shù)≥10的過程進行展示，詳見表4。KEGG通路富集共獲得37項，僅TGF-β通路P值大于0.05，詳見表5，運用Cytoscape 3.7.1對其進行網(wǎng)絡(luò)可視化，詳見圖4，圖中粉紅色三角形節(jié)點代表通路，藍色圓形節(jié)點代表基因，線條代表通路與基因之間的對應(yīng)關(guān)系。

表4 GO生物過程富集展示Table 4 The results of GO biological processes enrichment analysis

表5 KEGG通路富集圖Table 5 The results of KEGG pathways enrichment analysis

圖4 “通路-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 The pathway-target network

3 討論

骨重建失衡，骨吸收/骨形成比例升高是導(dǎo)致骨量丟失的直接原因。成骨細胞以及破細胞在骨重建的過程中扮演著重要的角色，成骨細胞由間充質(zhì)干細胞分化而來，成骨細胞可分泌骨基質(zhì)，骨基質(zhì)經(jīng)羥基磷灰石沉積后即完成礦化，礦化完成標(biāo)志骨重建過程結(jié)束[16]；破骨細胞由單核巨噬細胞前體分化而成，主司骨的吸收[17]，因此成骨細胞與破骨細胞的比例是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的關(guān)鍵也是治療的干預(yù)重點。OP可分為老年性、絕經(jīng)后以及特發(fā)性，老年性O(shè)P成因主要為隨著年齡增加，骨重建平衡被打破，造成骨量進行性丟失，絕經(jīng)后OP除增齡因素外，雌激素水平降低是更為重要的因素[18]，而特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥主要發(fā)生于青少年，目前病因尚不明確[19]。OP的發(fā)病機制大體如上述，但具體的調(diào)節(jié)機制受到諸多途徑的影響，本研究將從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析所得結(jié)果對仙靈骨葆治療OP的潛在機制進行討論。

3.1 活性成分與靶標(biāo)

高度值以及高中介中心度活性成分中槲皮素、山奈酚、木犀草素、淫羊藿苷元等均為黃酮類化合物，現(xiàn)有研究表明黃酮類化合物主要通過雌激素受體介導(dǎo)、OPG/RANK/RANKL、酶抑制作用、過氧化物酶增殖子激活受體介導(dǎo)、調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等機制預(yù)防OP[20]。槲皮素、山奈酚同屬于黃酮醇類，目前對于槲皮素治療OP較為明確的機制為抑制RANKL的活化[21]，OPG/RANK/RANKL機制是破骨細胞生成的關(guān)鍵，RANK與RANKL結(jié)合是促進破骨細胞分化的重要環(huán)節(jié)[22]，因此槲皮素可以抑制破骨細胞的生成，減少骨吸收。Kim等[23]發(fā)現(xiàn)山奈酚可抑制腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin，IL-6)的分泌，而TNF-α、IL-6可誘導(dǎo)巨細胞集落刺激因子(macro-phagecolony-stimulatingfactor，M-CSF)以及RANKL的表達，促進破骨細胞分化，抑制成骨細胞[18]。淫羊藿苷元及其苷類在體內(nèi)外均有增強成骨細胞活性，抑制破骨細胞活性的作用，而以淫羊藿苷元的作用最強[24]。除黃酮類活性成分外，丹參的活性成分較多，如丹參酮IIA、隱丹參酮等，丹參具有抗氧化、改善微循環(huán)，防止血栓等功能，但是近年來許多研究表明丹參及其有效成分具有抗OP或者改善骨代謝的作用[25]，如丹參酮IIA可促進間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化[26]、抑制破骨細胞生成前列腺素E2進而抑制骨吸收[27]。

高度值以及高中介中心度的靶標(biāo)共有24個，其中PTGS2(COX-2)的度值和中介中心度遠高于其他靶標(biāo)，推測PTGS2是仙靈骨葆的關(guān)鍵靶標(biāo)。PTGS1(COX-1)是度值排列第2的靶標(biāo)，與PTCS2均為前列腺素生成的主要限速酶[28]，而前列腺素可以誘導(dǎo)M-CSF以及RANKL的表達，促進破骨細胞分化，抑制成骨細胞功能[18]。此外在表1中AR(雄激素受體)至少與29個活性成分相關(guān)，現(xiàn)代研究表明雄激素與男性骨骼生長發(fā)育，骨量維持有關(guān)[29]，雄激素可以與成骨細胞表面的雄激素受體結(jié)合，促進成骨細胞分化[30]。ESR1(雌激素受體)至少與28個活性成分相關(guān)。二者均為仙靈骨葆的靶標(biāo)核心。整個活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖靶標(biāo)眾多，關(guān)聯(lián)復(fù)雜，可見仙靈骨葆的起效機制是多成分多靶點的相互作用，并且具有許多潛在的治療作用。

3.2 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)特征以細胞周期調(diào)節(jié)蛋白居多，高度值以及高中介中心度蛋白中TP53、AKT1、CDKN1A、JUN、CCNA2、CCND1、CDK1等蛋白均與細胞生長、分化、凋亡的調(diào)節(jié)有關(guān)，據(jù)此推測仙靈骨葆的作用特點在于調(diào)節(jié)成骨細胞以及破骨細胞的生長周期。值得一提的是表3中IL-6與STATA3之間的相互作用，陳鵬等[31]通過動物實驗表明將JAK2/STATA3通路阻斷引起IL-6無法表達后，骨質(zhì)疏松癥大鼠骨密度及ALP水平低于未阻斷組。此外PPI網(wǎng)絡(luò)圖尚與炎性因子、雌激素等相關(guān)。

3.3 GO生物過程富集以及KEGG通路富集

富集基因數(shù)較多的GO生物過程所反映的內(nèi)容與PPI網(wǎng)絡(luò)規(guī)律相似，均與細胞周期有關(guān)，炎癥反應(yīng)(IL-6、CXCL8等)、雌二醇反應(yīng)(ESR1)、血管新生反應(yīng)(VEGFA)均可與PPI中的蛋白相對應(yīng)。本研究所展示GO生物過程，正調(diào)控NF-kappaB轉(zhuǎn)錄活性因子為主要的過程之一，該過程與骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)機制吻合，即破骨細胞的激活依賴于核因子-κB受體活化配體[receptor activator of nuclear factor-κB (NF-κB) ligand，RANKL]與破骨細胞前體細胞上的RANK結(jié)合，從而激活NF-κB，促進破骨細胞分化[22]，骨質(zhì)疏松癥基因富集于該過程，上調(diào)NF-κB表達，從而引起骨質(zhì)疏松癥。而參與富集的基因均為仙靈骨葆所涉及的基因，說明仙靈骨葆膠囊可以對該過程進行調(diào)控，KEGG通路富集結(jié)果中NF-kappa B 信號通路富集了13個基因，亦佐證了這一結(jié)論。

KEGG通路富集結(jié)果中，富集基因數(shù)最多的通路為PI3K-Akt信號通路，有研究表明與正常小鼠相比Akt1和Akt2基因均敲除的小鼠骨量明顯下降，提示該通路與促進骨形成有關(guān)[32]。此外在對淫羊藿苷促進BMSCs分化的研究中發(fā)現(xiàn)加入PI3K阻斷劑后，淫羊藿苷的促進效果受到顯著抑制，提示該通路與BMSCs向成骨細胞分化有關(guān)[33]。TNF信號通路是富集基因數(shù)排列第2的通路，目前有研究表明，炎性因子TNF-α是絕經(jīng)后OP發(fā)生的主要原因之一，TNF-α可促進RANKL表達，誘導(dǎo)破骨細胞形成[34]。MAPK信號通路是調(diào)節(jié)成骨細胞生長分化的重要途徑，其中具有抗OP作用的主要有ERK通路、p38通路以及JNK通路，ERK通路可以促進骨保護素(osteoprotegerin，OPG)表達[35]，而OPG可以與RANK競爭性結(jié)合RANKL從而導(dǎo)致破骨細胞的凋亡[36]；p38通路則可以促進成骨細胞的礦化過程[37]；有研究表明JNK通路缺失后成骨細胞骨鈣蛋白以及骨橋蛋白表達明顯下降，因此JNK信號通路可能與成骨細胞后期分化有關(guān)[38]。KEGG通路結(jié)果中部分通路之間表現(xiàn)出協(xié)同作用，如HIF-1信號通路與VEGF通路，VEGF可作為HIF-1的下游目的基因，共同參與血管-骨形成的耦聯(lián)[39]；再如TGF-β信號通路、mTOR信號通路、AMPK信號通路，TGF-β1可以募集成骨細胞前體細胞，而成骨細胞可以分泌OPG，OPG可以通過mTOR信號通路以及AMPK信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，抑制破骨細胞分化；朱云艷等[38]發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體通路過表達可引起MAPK以及Akt磷酸化水平的下降。目前有研究表明甲亢是OP的危險因素之一，甲亢可致骨密度下降，由此可以推測，仙靈骨葆或可用于存在甲亢的OP患者。Prolactin(泌乳素)、Estrogen(雌激素)以及GnRH信號通路表明仙靈骨葆具有雌激素調(diào)節(jié)作用，是仙靈骨葆可運用于絕經(jīng)后OP的證據(jù)。

綜上所述，仙靈骨葆主要通過影響成骨細胞以及破骨細胞生長分化，調(diào)節(jié)骨代謝、雌激素等途徑干預(yù)OP。仙靈骨葆生物網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜龐大，本研究通過構(gòu)建“活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)對仙靈骨葆的核心活性成分以及靶標(biāo)進行了預(yù)測，PPI網(wǎng)絡(luò)對仙靈骨葆核心蛋白之間相互作用進行分析，運用David數(shù)據(jù)分析平臺進行GO生物富集以及KEGG通路分析，預(yù)測仙靈骨葆治療OP的起效機制，并引證現(xiàn)有研究結(jié)果進行對比，所得結(jié)果真實可信，為后續(xù)的仙靈骨葆藥理機制分析和實驗設(shè)計提供了數(shù)據(jù)支持。