川續(xù)斷提取物續(xù)斷皂苷Ⅵ防治骨質(zhì)疏松癥的研究進(jìn)展

趙金龍 梁桂洪 韓燕鴻 潘建科 曾令烽 李嘉暉 趙第 劉軍*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 5104052.廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院骨與關(guān)節(jié)退變及損傷研究團(tuán)隊(duì)，廣東 廣州 5101203.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(廣東省中醫(yī)院)，廣東 廣州 510120

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以低骨量和骨組織的微結(jié)構(gòu)退化，導(dǎo)致骨骼脆弱性增強(qiáng)和骨折風(fēng)險增加為臨床特征的一類全身性代謝性骨骼疾病[1-2]。OP為臨床常見且難于治療的骨代謝性疾病，其繼發(fā)性疾病可致殘、致死，如骨質(zhì)疏松性骨折、嚴(yán)重髖部骨折后臥床引發(fā)的并發(fā)癥、影響呼吸系統(tǒng)等[3]，影響老年人的健康生存質(zhì)量。目前，我國超過60歲以上人口已達(dá)2.1億，65歲以上人口約1.4億，老年人口絕對數(shù)目已經(jīng)世界第一，隨著人口老齡化的發(fā)展，OP已成為我國面臨的重要公共健康問題[4-5]。骨代謝平衡狀態(tài)直接影響骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展，根據(jù)骨質(zhì)疏松的發(fā)生機(jī)制，臨床用藥主要以促進(jìn)骨形成或抑制骨吸收作為主要的治療思路[6]，但目前臨床所應(yīng)用的抗骨質(zhì)疏松藥物均存在不同程度的缺陷，臨床上使用的抗骨質(zhì)疏松藥物均具有一定的不良反應(yīng)[7-8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[9-10]，川續(xù)斷在抗骨質(zhì)疏松領(lǐng)域具有較好的臨床療效，其中其主要化學(xué)單體續(xù)斷皂苷Ⅵ(asperosaponin Ⅵ)，又名木通皂苷D(akebia saponin D，ASD)，具有較強(qiáng)的抗OP功效[11-12]。本綜述將從ASD治療骨質(zhì)疏松的細(xì)胞水平層面及相關(guān)生物學(xué)通路進(jìn)行分析總結(jié)，以期為今后的ASD抗骨質(zhì)疏松相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)、臨床研究提供一定的指導(dǎo)，進(jìn)而為ASD等中藥單體抗骨質(zhì)疏松的精準(zhǔn)、靶向治療提供一定的參考。

1 續(xù)斷和ASD的提取

1.1 續(xù)斷

續(xù)斷為中醫(yī)藥學(xué)補(bǔ)陽之要藥，為多年生草本植物川續(xù)斷Dipsacus asper Wall. Ex Henry的干燥根，性溫，味苦、甘，歸肝腎經(jīng)，入藥可補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，續(xù)折傷，止崩漏[13]。本藥首次記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“主傷寒，補(bǔ)不足，金瘡，癰瘍，折跌，續(xù)筋骨，婦人乳難”。《神農(nóng)本草疏》云：“入足厥陰、少陰，為治胎產(chǎn)，續(xù)絕傷，補(bǔ)不足，療金瘡，理腰腎之要藥也”?！侗静輩R言》稱：“續(xù)斷，補(bǔ)續(xù)血脈之藥也”“所傷之筋，非此不養(yǎng)”。以上古籍記載均肯定了續(xù)斷治療骨傷科疾病的作用，現(xiàn)代臨床上續(xù)斷也被廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎等[13-14]。中醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為，續(xù)斷可以補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)筋健骨，可用于治療風(fēng)濕痹痛、療筋續(xù)斷?，F(xiàn)代研究結(jié)果表明[15]，續(xù)斷具有改善免疫、促進(jìn)骨損傷愈合、抗菌、抗炎等作用。高歌等[16]研究發(fā)現(xiàn)，續(xù)斷可能是通過AKT1、MAPK1等影響PI3K-AKT生物學(xué)通路，參與破骨細(xì)胞的調(diào)控，進(jìn)而起到抗骨質(zhì)疏松的生物學(xué)效應(yīng)。

1.2 ASD的提取及現(xiàn)代提取工藝研究

ASD的提取一般采用超聲法或回流法，朱海琳等[17]認(rèn)為在單因素試驗(yàn)中，超聲法及回流法對ASD提取的轉(zhuǎn)移率沒有明顯差異。乙醇回流法也被廣泛應(yīng)用于ASD的提取工藝中，但乙醇或其他醇類回流法的提取過程中會消耗大量乙醇等溶劑，此種提取方法耗費(fèi)較大的經(jīng)濟(jì)成本，但具有效率高、周期短、后期處理方便等優(yōu)點(diǎn)[18]。古丹丹等[19]采用單因素實(shí)驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇回流提取ASD具有較高的效率以及可操作性，該實(shí)驗(yàn)以ASD轉(zhuǎn)移率為評價標(biāo)準(zhǔn)，其研究認(rèn)為ASD在乙醇回流法中最佳的提取方法是使用6倍濃度為65%的乙醇共提取3次，每次2 h，該實(shí)驗(yàn)中采用此種提取方法得出的ASD轉(zhuǎn)移率為101.52%。超聲法在中藥成分的提取應(yīng)用中，體現(xiàn)出了具有提取時間短、提出率高、設(shè)備簡單等益處，在中藥成分的提取應(yīng)用中得到廣泛的認(rèn)可[20]。朱海琳等[21]采用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化續(xù)斷ASD的超聲提取工藝進(jìn)行研究，以ASD轉(zhuǎn)移率為評價標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及數(shù)學(xué)方程式確定ASD的最佳提取工藝參數(shù)：超聲時間 33.13 min，乙醇濃度51.58%，液料比23.39 mL/g，該研究中采用該實(shí)驗(yàn)參數(shù)得到的ASD轉(zhuǎn)移率為(88.39±0.21)%，該研究進(jìn)一步為超聲提取方法的工藝參數(shù)提供了可靠的依據(jù)，為進(jìn)一步的ASD提取工藝發(fā)展及其他中藥成分的提取提供了借鑒。

2 ASD促進(jìn)骨形成研究

2.1 ASD對BMSCs成骨分化及相關(guān)信號通路研究

OP是由于成骨細(xì)胞(osteoblasts，OB)活性的減弱或破骨細(xì)胞活性的增加而導(dǎo)致骨骼密度的減少、骨骼脆性增加。成骨細(xì)胞的生物學(xué)過程與骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展密切相連，而成骨細(xì)胞的重要來源為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)，BMSCs在相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子的推動下，能夠進(jìn)一步分化為成骨細(xì)胞，從而促進(jìn)骨形成[12,18]，可見BMSCs在人類骨骼代謝中至關(guān)重要。Cai等[22]研究人員認(rèn)為BMSCs與OP的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，BMSCs的分化程度可能直接影響OP的發(fā)展進(jìn)程，因此對BMSCs的生物學(xué)過程向著有利于控制骨質(zhì)疏松方向進(jìn)行調(diào)控，可以作為防治骨質(zhì)疏松的思路和手段。李家等[23]研究人員發(fā)現(xiàn)ASD可以促進(jìn)BMSCs的分化，提升BMSCs的細(xì)胞活力，從而促進(jìn)骨形成，增加骨量，改善骨小梁的微觀結(jié)構(gòu)。相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[24]，ASD可以促進(jìn)大鼠體外MSCs向成骨細(xì)胞方向進(jìn)行增值分化，從而促進(jìn)骨形成，防治骨質(zhì)疏松，該生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮可能與其升高Cbfa1 mRNA的表達(dá)有一定聯(lián)系。

黃媛等[25]認(rèn)為ASD可以誘導(dǎo)BMSCs分化成為成骨細(xì)胞，其中c-Jun和轉(zhuǎn)錄激活因子4(ATF4)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)在其中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，可能與BMP-2在一定程度上誘導(dǎo)c-Jun等的磷酸化，激活了JNK信號通路，在其研究中通過抑制JNK通路，成骨細(xì)胞的分化、骨鈣素的表達(dá)及ALP活性均受到不同程度的抑制，因此認(rèn)為ASD可以通過JNK信號通路促進(jìn)BMSCs分化，從而防治骨質(zhì)疏松。另有相關(guān)研究認(rèn)為[23]，ASD促進(jìn)了BMSCs的成骨分化，其中Wnt信號通路可能發(fā)揮了較重要的作用，ASD可以升高BMP-2、Runx2等基因的表達(dá)，而Wnt信號阻斷劑可以阻斷或減少此類成骨基因的作用，基于此原理，ASD可能是通過干預(yù)Wnt通路，削減Wnt信號阻斷劑的作用，促進(jìn)相關(guān)成骨基因的表達(dá)，起到增加骨量、改善骨小梁微結(jié)構(gòu)的作用。另有觀點(diǎn)認(rèn)為[12,26]，ASD在可以促進(jìn)大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化，該生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮可能與MAPK途徑的p38 MAPK和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)蛋白存在密切的聯(lián)系。

2.2 ASD對成骨細(xì)胞成骨的影響及相關(guān)信號通路研究

ASD可推動成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(MC3T3-E1)和原代成骨細(xì)胞的生化進(jìn)展過程，包括繁殖、分化等，ASD可以提升成骨細(xì)胞ALP的生物學(xué)活性，促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)的合成，同時激活p38 MAPK和ERK1/2進(jìn)而推動骨形成[27-28]。張?jiān)戚x等[27]研究認(rèn)為ASD可以推動骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，這進(jìn)一步揭示ASD對于成骨細(xì)胞的影響，主要通過影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的繁殖、分化。經(jīng)過筆者對大量ASD對成骨細(xì)胞影響的文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)[9, 23-24, 27]，現(xiàn)有研究認(rèn)為ASD對成骨細(xì)胞的影響，主要是通過調(diào)控BMSCs的發(fā)生、發(fā)展間接促進(jìn)成骨，進(jìn)而產(chǎn)生抗OP的作用。

BMP-2與BMP受體兩者相結(jié)合，可誘導(dǎo)形成異源復(fù)合物受體，進(jìn)一步推動MAPK信號通路中ERK1/2蛋白的磷酸化[29]。ERK1/2蛋白的激活可以逆向促進(jìn)BMP-2蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和成熟，因此在促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化與成熟過程中，MAPK信號通路發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[9,27]。有研究發(fā)現(xiàn)[23]，ASD可以促進(jìn)β-catenin、Runx2以及OCN基因的表達(dá)，而通過使用Wnt信號阻斷劑對BMSCs進(jìn)行預(yù)先處理后，可以降低ASD誘導(dǎo)的成骨基因表達(dá)，這從側(cè)面印證了ASD可通過W nt/β-catenin信號通路促成骨分化。有研究[25]將JNK信號通路阻斷后，ASD誘導(dǎo)成骨分化的生物學(xué)過程受到抑制，因此JNK信號通路的激活可能是ASD促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的其中一種分子機(jī)制。Ke等[11]研究認(rèn)為，ASD具有促進(jìn)卵母細(xì)胞增殖、成骨分化和礦化的作用，ASD可以促進(jìn)BMP-2表達(dá)和p38 MAPK和ERK1/2活化，證實(shí)其在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化中的作用依賴于BMP-2等[30]，Runx2的表達(dá)增加依賴于PI3K/AKT信號通路。BMP-2能夠促進(jìn)成骨基因RUNX2的表達(dá)，Runx2能夠通過增加PI3K、AKT的蛋白水平來提高PI3K/AKT信號通路的活性。此外，PI3K/Akt信號增強(qiáng)了Runx2和 Runx2依賴轉(zhuǎn)錄的DNA結(jié)合，這種正反饋回路進(jìn)一步增強(qiáng)了成骨細(xì)胞分化過程中Runx2的活性[31]，因此ASD的成骨分化可能與PI3K/AKT信號通路密切相關(guān)。

3 ASD對破骨細(xì)胞活性影響的研究

OP的發(fā)病機(jī)制主要與骨形成及骨吸收兩者的代謝失衡密切相關(guān)，破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)的生物學(xué)活動在OP的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用?，F(xiàn)已發(fā)表的中外文獻(xiàn)中，闡述ASD在破骨細(xì)胞層面發(fā)揮生物學(xué)作用的研究尚少，主要集中在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及ASD在生物學(xué)通路調(diào)控破骨細(xì)胞治療OP或骨代謝相關(guān)疾病的研究尚缺。現(xiàn)關(guān)于ASD與破骨細(xì)胞的研究，主要是通過牙科領(lǐng)域動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C實(shí)了ASD可以增強(qiáng)牙周破骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)牙槽吸收及重建。陳佩佩等[32-33]研究ASD對大鼠正畸牙周組織改建的影響中發(fā)現(xiàn)，局部注射ASD可明顯促進(jìn)壓力側(cè)牙周組織破骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成，進(jìn)而推動牙周改建的進(jìn)程并加速正畸牙移動。亦有研究結(jié)果認(rèn)為[34]，ASD通過使血液循環(huán)代謝加快，間接推動破骨細(xì)胞功能活躍，而破骨細(xì)胞誘導(dǎo)的壓力側(cè)促進(jìn)牙槽骨吸收，并且認(rèn)為成骨細(xì)胞發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，而在在張力側(cè)會促進(jìn)新骨生成，新骨的生成也需要成骨細(xì)胞干預(yù)，而ASD對牙周成骨細(xì)胞的作用仍需進(jìn)一步探討。鑒于目前闡述ASD與破骨細(xì)胞之間關(guān)系的研究有限，ASD是否能夠?qū)ρ乐芙M織以外的破骨細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)及藥理學(xué)上的干預(yù)，促進(jìn)相關(guān)破骨細(xì)胞的凋亡或提升其活躍性，從而調(diào)整破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的動態(tài)平衡，進(jìn)而起到防治骨質(zhì)疏松的作用，尚需大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)掘、研究及驗(yàn)證。

4 小結(jié)

目前臨床上使用的骨質(zhì)疏松藥物大部分為骨吸收抑制劑(如雌激素、降鈣素等)，而骨形成相關(guān)藥物不足，藥物的臨床療效主要是改善癥狀、延緩病情進(jìn)展，仍然未能逆轉(zhuǎn)病情甚至治愈[35]，且大部分抗骨質(zhì)疏松藥均存在一定的不良反應(yīng)[36]。大量的實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明[10, 37]，續(xù)斷具有促進(jìn)骨形成、防治OP的藥理功效。ASD具有通過多種生物學(xué)通路促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的潛在功效，從而起到防治OP的作用[23-25]。

ASD可以從多個細(xì)胞層次及不同的生物學(xué)信號通路調(diào)節(jié)骨代謝，從而起到抗骨質(zhì)疏松的功用，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：ASD可以促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞方向進(jìn)行繁殖、分化，可能是通過JNK、Wnt、p38 MAPK等信號通路促進(jìn)BMSCs分化，促進(jìn)骨形成，從而防治骨質(zhì)疏松；ASD可以通過多條生物學(xué)信號通路影響成骨細(xì)胞的繁殖及分化，其中可能與ASD調(diào)節(jié)骨細(xì)胞ALP、BMP-2、Runx2等細(xì)胞因子或蛋白成分，激活MAPK、β-catenin、PI3K/AKT等信號通路，進(jìn)而促進(jìn)骨形成，起到抗OP的作用(如圖1)。此外，本綜述發(fā)現(xiàn)目前闡述ASD與破骨細(xì)胞之間關(guān)系的研究十分有限，ASD是否能夠?qū)ρ乐芙M織以外的破骨細(xì)胞有所抑制，從而調(diào)整破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的動態(tài)平衡，進(jìn)而起到防治骨質(zhì)疏松的作用，或是ASD對于破骨細(xì)胞在人體不同部位的骨骼組織、骨代謝有著雙向調(diào)節(jié)作用，可抑制破骨細(xì)胞活性，亦可增強(qiáng)破骨細(xì)胞活動，尚需大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)掘、研究及驗(yàn)證。

圖1 ASD抗骨質(zhì)疏松的機(jī)制關(guān)系圖Fig.1 The mechanism of ASD against osteoporosis

綜上所述，ASD能夠在多個細(xì)胞層面以及通過多種信號通路對成骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，起到增加骨骼密度，改善骨小梁微觀結(jié)構(gòu)的效用，并能有效地防治骨質(zhì)疏松及其繼發(fā)性疾病。許多國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)及臨床研究結(jié)果表明，ASD在治療OP方面具有巨大的藥理學(xué)潛力及臨床應(yīng)用價值，但目前以ASD單體成分研發(fā)的抗骨質(zhì)疏松藥物尚無，部分藥理學(xué)作用機(jī)理仍不清楚，如ASD通過干預(yù)破骨細(xì)胞能否抗骨質(zhì)疏松，因此ASD是否能進(jìn)一步推廣應(yīng)用于臨床，尚需要大量的基礎(chǔ)動物實(shí)驗(yàn)、多中心臨床試驗(yàn)提供有力的循證依據(jù)，以進(jìn)一步明確ASD作用的生物學(xué)通路、作用靶點(diǎn)。