裸花紫珠UPLC 指紋圖譜的建立

鄧杰仁楊義芳 李小鋒章弘揚吳永忠胡 坪康興東楊 揚王月榮*肖軍平*

（1.華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海市功能材料化學(xué)重點實驗室，上海 200237； 2.上海藥辰生物科技有限公司，上海 200060； 3.江西普正制藥有限公司，江西吉安 343100； 4.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200040）

裸花紫珠Callicarpa nudifloraHook.et Arn.是馬鞭草科紫珠屬植物的干燥地上部分［1］，全年均可采收，具有收斂止血、清熱解毒的功效，可用于各種內(nèi)外出血癥，對肺胃之出血尤為多用，也可治療燒燙傷及熱毒瘡癌［2］。1977 年版《中國藥典》 曾收錄裸花紫珠，2015 年版新增中藥品種中也收錄了該藥材［3-4］，對其指紋圖譜的建立已有報道［5-8］，但該藥材成分復(fù)雜，文獻(xiàn)方法分離度不夠、檢測種類偏少，缺乏對其中各指紋峰的鑒定數(shù)據(jù)。為此，本研究建立裸花紫珠UPLC 指紋圖譜，使用二極管陣列檢測器（DAD） 和四極桿-飛行時間質(zhì)譜（Q-TOF-MS） 對其指紋峰進(jìn)行鑒定，并結(jié)合主成分分析用于該藥材與其他紫珠屬樣品的快速鑒別。

1 材料

1.1 儀器 Waters ACQUITY ARCTM超高效液相色譜儀，配有二元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器（美國沃特世公司）；Agilent 1290 超高效液相色譜-6530 四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀，配有二元高壓梯度泵、可控溫自動進(jìn)樣器、可控溫柱溫箱、二極管陣列檢測器和電噴霧離子源（美國安捷倫公司）；天平（萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 毛蕊花糖苷（批號M-011-170315）、連翹酯苷B （批號L-013-170421） 對照品均購于成都瑞芬思生物科技有限公司；木犀草苷（批號PRF8030242）、咖啡酸（批號PRF7102121） 對照品均購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；木犀草素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素-3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品為實驗室自制，純度均≥98%。15 批裸花紫珠（S1～S15） 經(jīng)江西普正制藥有限公司吳永忠研究員鑒定為馬鞭草科裸花紫珠Callicarpa nudifloraHook.et Arn.的干燥葉；5 批紫珠屬其他品種藥材（S16～S20） 經(jīng)其鑒定分別為杜虹花C.formosana、廣東紫珠C.kwangtungensis、大葉紫珠C.macrophylla、小葉紫珠C.dichotoma、枇杷葉紫珠C.kochiana，密封后保存于陰涼干燥處，具體見表1。乙腈、甲酸（美國ACS 公司，色譜純）；甲醇（上海泰坦科技股份有限公司，分析純）；屈臣氏蒸餾水（北京屈臣氏蒸餾水有限公司）。

2 方法

2.1 對照品溶液制備 精密稱取毛蕊花糖苷、木犀草苷、連翹酯苷B、咖啡酸、木犀草素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素-3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品適量，80%甲醇溶解，即得（0.5 mg／mL），0.22 μm 微孔濾膜過濾，4 ℃下冷藏備用。

2.2 供試品溶液制備 裸花紫珠粉碎后過40 目篩，稱取粉末約0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入80% 甲醇水溶液25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（500 W、40 kHz） 提取45 min，放冷，用80% 甲醇補足失質(zhì)量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

表1 樣品信息

2.3 色譜條件 Phenomenex kintex XB-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流動相0.1% 甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，8%～14%B；5～15 min，14%B；15～20 min，14%～18% B；20～30 min，18%～22% B；30～40 min，22%～30% B；40～45 min，30%～50% B；45～55 min，45%～60% B）；體積流量0.3 mL／min；檢測波長332 nm；柱溫45 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.4 質(zhì)譜條件 在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行，毛細(xì)管電壓分別為3 500、3 000 V；干燥氣溫度350 ℃，體積流量10 L／min；霧化氣壓力30 psi （1 psi ＝6.895 kPa）；毛細(xì)管出口電壓150 V；m／z50～1 500；掃描速率1 張譜圖／s。質(zhì)量校正液離子分別為m／z121.050 9、922.009 8 （正離子模式） 和m／z112.985 6、1 033.988 1 （負(fù)離子模式）。

2.5 樣品測定 取15 批裸花紫珠和5 批其他紫珠屬藥材，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進(jìn)樣。取代表性樣品（S1），在“2.3”“2.4”項條件下進(jìn)樣，記錄總離子流圖。色譜數(shù)據(jù)采用Waters Empower3.0軟件處理，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Agilent MassHunter 軟件處理。

2.6 數(shù)據(jù)處理 所有裸花紫珠藥材的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012 版），經(jīng)中位數(shù)法進(jìn)行多點校正，對色譜峰進(jìn)行自動匹配，生成色譜指紋圖譜共有模式作為對照指紋圖譜，計算相似度。所有藥材共有峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA P＋14.0 軟件，經(jīng)Pareto-scaling預(yù)處理后進(jìn)行主成分分析。

3 結(jié)果

3.1 特征圖譜建立 按“2.2”項下方法制備供試品溶液（S1），在“2.3”項色譜條件下進(jìn)樣，特征指紋圖譜見圖1，共獲得19 個共有指紋峰。其中，木犀草苷（9 號峰）分離度良好，峰面積適中，故確定其作為內(nèi)參峰。

圖1 各成分UPLC 色譜圖

3.2 指紋峰鑒定 根據(jù)Q-TOF-MS 提供的精確質(zhì)量數(shù)以及DAD 檢測器提供的紫外吸收信息，參考相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)合可獲得的對照品，對19 個指紋峰進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表2。由此可知，藥材中主要成分為苯乙醇苷類、黃酮類、有機酸類環(huán)烯醚萜苷類等。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 精密度試驗 精密稱取樣品粉末 （S1） 1 份（0.5 g），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得各指紋峰相對保留時間RSD 小于0.2%，相對峰面積RSD 小于1.9%，表明儀器精密度良好。

3.3.2 重復(fù)性試驗 精密稱取樣品粉末（S1） 6 份，每份0.5 g，按“2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進(jìn)樣，測得各指紋峰相對保留時間RSD 小于0.2%，相對峰面積RSD 小于2.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取樣品粉末 （S1） 1 份（0.5 g），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下于0、2、4、6、12、24 h 進(jìn)樣，測得各指紋峰相對保留時間RSD 小于0.2%%，相對峰面積RSD 小于2.8%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4 相似度分析 15 批樣品UPLC 指紋圖譜及所生成的對照指紋圖譜見圖2，相似度見表3。由此可知，1～15 號樣品的相似度均大于0.960，而16～20 號樣品均小于0.770，表明指紋圖譜能很好地區(qū)分裸花紫珠與其他紫珠屬藥材。

表2 裸花紫珠成分UPLC-DAD-Q-TOF-MS 鑒定結(jié)果

3.5 主成分分析 按“2.6”項下方法處理后，各樣品的主成分分析結(jié)果見圖3。由此可知，15 批樣品聚為一類，并與5 批其他紫珠屬藥材在PC1 軸上明顯分開，表明指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)可快速鑒別裸花紫珠。

圖3 15 批裸花紫珠與5 批其他紫珠屬藥材主成分分析圖

4 討論

4.1 色譜條件篩選 本實驗考察了Agilent Eclipse Plus-C18RRHD （2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）、Agilent Eclipse Plus-C18RRHD （2.1 mm×150 mm，1.8 μm）、Phenomenex kintex XB-C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm） 色譜柱的分離效果，最終選擇分離度最佳的第3 種色譜柱。

考察了不同流動相（甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸、乙腈-甲酸）、柱溫（30、35、40、45、50 ℃）、體積流量（0.2、0.25、0.3、0.35 mL／min） 的影響。結(jié)果表明，采用流動相乙腈-甲酸、柱溫45 ℃、體積流量0.3 mL／min 時，各色譜峰分離度良好、基線平穩(wěn)、系統(tǒng)壓力較低，適用于指紋圖譜分析。使用DAD 檢測器進(jìn)行紫外全波長掃描，發(fā)現(xiàn)在332 nm 波長下色譜基線噪音較低、特征峰響應(yīng)較高，且色譜峰信息較完全，故選擇其作為檢測波長。

4.2 提取方法 對提取方式（超聲、回流）、提取溶劑（純水、20% 甲醇、40% 甲醇、50% 甲醇、60% 甲醇、80%甲醇、純甲醇、純乙醇）、提取時間 （15、30、45、60、75、90 min）、溶劑體積 （10、25、40、50、65、75 mL）進(jìn)行考察。最終確定，最佳提取方法為25 mL 80% 甲醇超聲45 min。

4.3 化合物鑒定 峰1、2、3、4、5、7、8、10、12、14、16、17 的UV 信號符合苯丙烯酸衍生物光譜特征：220 nm有小峰吸收和肩峰，260 nm 左右有最小吸收峰，260～330 nm 間有一個肩峰，在330 nm 左右有最大吸收峰。峰6、9、11、13、15、18、19 的UV 信號與黃酮類化合物類似：黃酮類化合物的UV 譜通常有2 個吸收帶，吸收帶Ⅰ位于290～380 nm，是分子中C 環(huán)和B 環(huán)上的羰基共軛體系的紫外吸收，位于240～280 nm 的吸收帶Ⅱ是A 環(huán)與C 環(huán)上羰基共軛體系的紫外吸收［24］。Q-TOF-MS 測定時發(fā)現(xiàn)，這些化合物在正模式下可生成［M＋H］＋、［M＋Na］＋、［M＋NH4］＋、［M ＋K］＋加合離子，而在負(fù)模式下可生成［MH］-、［M＋Cl］-、［M＋COOH］-加合離子，由此可以準(zhǔn)確推斷出化合物的精確分子量和分子式，從而有助于鑒定。通過查閱關(guān)于裸花紫珠已有文獻(xiàn)，并與以上DAD 及高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)比較，鑒定了19 個指紋峰。

5 結(jié)論

本研究建立了裸花紫珠UPLC 特征指紋圖譜，利用Q-TOF-MS 和DAD 檢測器對19 個指紋峰進(jìn)行鑒定。指紋圖譜結(jié)合相似度評價和主成分分析時，可實現(xiàn)裸花紫珠與其他紫珠屬藥材的區(qū)分，并為合理利用該藥材提供參考。