基于聚類分析中國林蛙皮不同時期多不飽和脂肪酸含量變化規(guī)律

汪卓明 孫敬蒙 張小雯 寧勁濤 辛 宇 高文義*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春，130117；2.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院藥學(xué)部，長春，130021)

中國林蛙(Ranachensinensis)是我國傳統(tǒng)的名貴動物藥，我國著名的集食藥用于一身的經(jīng)濟(jì)蛙種[1-2]。被大家所熟知的林蛙油是雌性林蛙輸卵管的干制品，又稱蛤蟆油、雪蛤油，號稱“綠色軟黃金”，具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)陰潤肺、滋補(bǔ)強(qiáng)壯等功能[3]，主要用于身體虛弱、病后失調(diào)、精神不足和癆嗽咳血等癥。然而，中國林蛙加工生產(chǎn)成林蛙油后，大量的林蛙皮膚被丟棄，造成生物資源的極度浪費(fèi)。林蛙皮中含有多種有益的活性成分及營養(yǎng)物質(zhì)[4-5]，例如蛋白質(zhì)、多糖、生物活性肽以及透明質(zhì)酸等[6]。除此之外，林蛙皮膚中富含多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)，其能通過減少血小板的黏附作用從而降低血栓形成的概率，通過調(diào)節(jié)腸道菌群來促進(jìn)脂質(zhì)代謝，且具有降低血脂、增強(qiáng)腦活力、預(yù)防高血壓、改善免疫機(jī)制缺乏和抗癌等作用[7]。

PUFA是構(gòu)成生物體內(nèi)脂肪的一種脂肪酸，也是人體不可缺少的脂肪酸。根據(jù)雙鍵的位置及功能可將PUFA分為ω-6系列和ω-3系列。亞油酸和花生四烯酸(arachidonic acid，AA)屬ω-6系列，亞麻酸、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)屬ω-3系列[8]。各系列PUFA在機(jī)體的保護(hù)和調(diào)節(jié)方面都起著重要作用，例如：調(diào)節(jié)血脂、清理血栓及調(diào)節(jié)免疫等。另外，DHA是視網(wǎng)膜的重要組成部分，約占視網(wǎng)膜的40%—50%。補(bǔ)充足夠的DHA對活化衰落的視網(wǎng)膜細(xì)胞很有幫助。同時，DHA是大腦細(xì)胞形成發(fā)育及運(yùn)動不可缺少的物質(zhì)基礎(chǔ)，人有記憶力和思維功能都有賴于DHA的維持和提高[9]。AA作為大腦發(fā)育的重要物質(zhì)，對DHA和EPA的合成起著重要作用，且AA能快速地與磷脂結(jié)合，使脂肪酸更有效地被機(jī)體利用。EPA和DHA還可通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)的方式改變血管內(nèi)皮功能，降低全身血管阻力，進(jìn)而降低高血壓。因此，林蛙皮不僅具有美容養(yǎng)顏和延緩衰老的功效，還可以快速緩解疲勞以及提高人體免疫力，擁有巨大的研究意義和開發(fā)前景。

中國林蛙在東北地區(qū)主要分布于兩大山區(qū)，即長白山區(qū)域和小興安嶺山區(qū)，其中長白山區(qū)域是主分布區(qū)。不僅與地理?xiàng)l件有重要的關(guān)系，一年四季各月份的溫度及氣候等條件也與中國林蛙的生長發(fā)育有著密切關(guān)系[10]。為此，本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜法測定靖宇縣林蛙產(chǎn)地同年9個不同生長期中國林蛙皮膚中PUFA含量，分析不同時期林蛙皮中PUFA含量變化規(guī)律，為改善林蛙養(yǎng)殖條件和確定林蛙皮品質(zhì)最佳期提供有力的依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 7890B型氣相色譜儀(安捷倫公司)；XW-80A型漩渦混合儀(海門市其林貝雨儀器制造有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型真空泵(河南省予華儀器有限公司)；KXJ-ZZB型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；IKAT10型勻漿機(jī)(北京東方大林科技有限公司)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(海門市其林貝雨儀器制造有限公司)；JA5103N型電子天平(上海民僑精細(xì)科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試劑

37種脂肪酸甲酯混標(biāo)(XA23076)、十七烷酸內(nèi)標(biāo)(批號1002403079)、正己烷(批號WXBC0860V)均由SIGMA公司提供；甲醇(批號20180521)、三氯甲烷(批號20180620)、鹽酸(批號20160718)、無水硫酸鈉(批號20170301)均由北京化工廠提供；焦性沒食子酸(批號20170317)、石油醚(批號20171210)均由天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司提供；0.9%生理鹽水(批號S17081614-1)由吉林康乃爾藥業(yè)有限公司提供。

1.3 中國林蛙組織(皮膚)取樣

本實(shí)驗(yàn)所用中國林蛙均來自于吉林省靖宇縣優(yōu)良林蛙產(chǎn)地，根據(jù)中國林蛙生長發(fā)育規(guī)律，于2018-01-08、2018-03-08、2018-03-19、2018-04-09、2018-04-26、2018-09-05、2018-09-21、2018-10-18和2018-11-27分別去靖宇縣當(dāng)?shù)夭杉煌l(fā)育時期自然條件下的新鮮活體中國林蛙。用毀髓法處死后，立即解剖得到不同時期林蛙皮樣品，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 氣相色譜條件

色譜柱：SPTM-2560型色譜柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)。

氣體及流量：載氣(N2，純度99.999%)流速0.507 72 mL/min，尾吹流速30.0 mL/min，氫氣流速40 mL/min，空氣流速400 mL/min。

進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。

溫度及程序升溫：開始溫度100 ℃保持5 min，以4 ℃/min速率升溫至240 ℃，保持30 min。

2.2 系統(tǒng)適用性

在“2.1”項(xiàng)氣相色譜條件下，可以較好地分離37種脂肪酸甲酯混標(biāo)和供試品溶液，且內(nèi)標(biāo)出峰時間為42.778 min，陰性無干擾，系統(tǒng)適應(yīng)性良好。結(jié)果見表1、圖1、圖2、圖3和圖4。

圖4 陰性對照色譜圖Fig.4 Negative control chromatogram

圖3 對照品色譜圖Fig.3 Chromatogram of the reference

圖2 供試品色譜圖Fig.2 Chromatogram of the test sample

圖1 37種脂肪酸甲酯混標(biāo)色譜圖Fig.1 37 fatty acid methyl esters mixed standard chromatogram

表1 37種脂肪酸甲酯混標(biāo)出峰時間Tab.1 37 fatty acid methyl esters mixed peak time

2.3 溶液的配制2.3.1 內(nèi)標(biāo)物溶液

精密稱取十七烷酸5 mg，置于5 mL量瓶中，加正己烷定容至刻度，充分搖勻，即得。

2.3.2 對照品溶液

精密量取100 μL 37種脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品(Supelco 37 Component FAME Mix)置1 mL量瓶中，用正己烷定容至刻度，即得對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液

稱取約1 g中國林蛙皮膚，加入焦酚(也稱焦性沒食子酸)，置于干燥的離心管中，加入NaCl溶液2.5 mL，十七烷酸內(nèi)標(biāo)，勻漿，加甲醇，勻漿，加氯仿，勻漿，離心5 min，吸取下層，剩余上層中加氯仿、生理鹽水，使用渦旋混合儀渦旋，離心，吸取下層。剩余上層繼續(xù)加氯仿、生理鹽水，渦旋，吸取下層，將3次取的下層溶液合并，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀氮?dú)獯蹈?。加入鹽酸-甲醇，密封條件下，100 ℃加熱30 min，取出放置至室溫，加入去離子水、石油醚，渦旋，離心，將上層溶液取出，下層加入石油醚，渦旋，離心，再取出上層，下層溶液加入石油醚，渦旋，離心，取出上層，將所取上層溶液合并，加入去離子水，充分振蕩，離心，將下層吸出并棄去，向上層中加入去離子水，充分振蕩，離心，將下層吸出并棄去，加入去離子水等量，充分振蕩3 min，離心5 min，反復(fù)操作，將上層溶液洗至pH 5.0—6.0，上層溶液中加入無水硫酸鈉，靜置。將液體倒出，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀氮?dú)獯蹈?，用正己烷充分溶解并定容? mL，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取十七烷酸甲脂對照品溶液(1 mg/mL)0.06 mL、0.09 mL、0.12 mL、0.18 mL、0.24 mL，分別置于1 mL容量瓶中，加正己烷定容至刻度，搖勻，配成不同濃度的十七烷酸甲脂對照品溶液。依次注入氣相色譜儀測定，記錄峰面積，以對照品色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對照品濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得回歸方程。結(jié)果見表2、圖5。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定結(jié)果Tab.2 Standard curve measurement results

圖5 內(nèi)標(biāo)線性關(guān)系曲線Fig.5 Internal standard linear relationship curve

以十七烷酸甲酯濃度(x)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=2 034.7x+11.146，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，表明十七烷酸甲酯對照品的線性關(guān)系良好。

2.5 重復(fù)性

結(jié)果表明，PUFA供試品溶液的RSD為2.26%—3.36%，表明測定方法重現(xiàn)性良好。

2.6 穩(wěn)定性

結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)測定結(jié)果的RSD為1.73%—2.88%，表明供試品的穩(wěn)定性良好，即24 h內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定可靠。

2.7 樣品含量測定

于吉林省靖宇縣2018年1月、3月、4月、9月、10月及11月取蛙，每個月份按“2.3.3”項(xiàng)下方法平行制備6份獨(dú)立供試品溶液，再按“2.1”氣相色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品中各PUFA含量，結(jié)果見表5、表6。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Repeatability test results

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Stability test results

表5 2018年不同時期中國林蛙皮膚PUFA含量測定結(jié)果Tab.5 Results of PUFA content in skin of Rana chensinensis in different periods of 2018 /(mg/100 g)

續(xù)表5

表6 不同時期中國林蛙皮中PUFA平均含量Tab.6 Average PUFA content of Rana chensinensis skin in different periods

由圖7、圖8可知，林蛙皮中EPA、DHA含量變化趨勢較為相似，1—4月含量逐漸降低，4—9月含量開始回升，9—11月又開始降低。由圖6可知，林蛙皮中AA由1—9月逐漸升高，9—11月降低，9月含量達(dá)到最高值。由圖9可知全年中國林蛙皮中DHA含量最高，EPA含量次之，AA含量最低。

圖6 不同時期中國林蛙皮膚中AA含量變化趨勢Fig.6 Trends of AA content in skin of Rana chensinensis in different periods

圖7 不同時期中國林蛙皮膚中EPA含量變化趨勢Fig.7 Trends of EPA content in skin of Rana chensinensis in different periods

圖8 不同時期中國林蛙皮膚中DHA含量變化趨勢Fig.8 Trends of DHA content in skin of Rana chensinensis in different periods

圖9 不同時期中國林蛙皮膚中AA、EPA和DHA含量變化Fig.9 Cylindrical charts of AA，EPA and DHA contents in skin of Rana chensinensis in different periods

2.8 聚類分析

根據(jù)表6用SPSS軟件對不同時期林蛙皮膚中PUFA含量進(jìn)行聚類分析，采用離差平方和法，以歐氏距離為區(qū)間進(jìn)行聚類，將時期2018-01-08、2018-03-08、2018-03-19、2018-04-09、2018-04-26、2018-09-05、2018-09-21、2018-10-18、2018-11-27分別編號為數(shù)字1、2、3、4、5、6、7、8、9，結(jié)果見圖10。

圖10 聚類分析Fig.10 Cluster analysis tree

不同時期林蛙皮中重要PUFA平均含量變化見圖9，由圖9、圖10可知，9個時期林蛙皮樣品可聚為4大類：時期2018-09-21聚為一類，記為第一類，此類林蛙皮樣品中3種重要PUFA含量均明顯高于總體平均值；時期2018-09-05聚為一類，記為第二類，此類林蛙皮樣品中AA、EPA含量均高于總體平均值，DHA含量均略低于總體平均值；時期2018-01-08、2018-04-26聚為一類，記為第三類，此類林蛙皮樣品中3種重要PUFA含量與總體平均值相比有高有低；時期2018-03-08、2018-03-19、2018-04-09、2018-10-18、2018-11-27聚為一類，記為第四類，此類林蛙皮樣品中3種重要PUFA含量均低于總體平均值。綜上可知，不同時期中國林蛙皮中PUFA含量存在差異，其中時期2018-09-21和2018-09-05中國林蛙皮中PUFA含量較高。

3 小結(jié)與討論

中國林蛙生長過程按時間劃分全年可分為7個階段：第一階段為深居冬眠期，時間為12至次年2月；第二階段為出蟄前期，時間為2—3月；第三階段為出蟄期成蛙產(chǎn)卵期，時間為3—5月；第四階段為上岸后捕食生長期，時間為5—9月；第五階段為入蟄前期，時間為9—10月；第六階段為入蟄期，時間為10—11月；第七階段為散居冬眠期，時間為11—12月。本實(shí)驗(yàn)通過對吉林省靖宇縣全年不同時期中國林蛙皮膚中PUFA進(jìn)行含量測定并聚類分析發(fā)現(xiàn)各時期PUFA含量高低順序?yàn)榈谝活悤r期含量>第二類時期含量>第三類時期含量>第四類時期含量，即中國林蛙在其深居冬眠期和上岸后捕食生長期時皮膚中重要PUFA含量較高。AA、EPA和DHA等重要PUFA在促進(jìn)機(jī)體代謝、增加供氧量及增強(qiáng)免疫力等方面都有重要作用。由此可知中國林蛙在冬眠期和捕食期這兩個急需抗寒和供能的重要時期中都需要大量的PUFA供應(yīng)。