響應(yīng)面法優(yōu)化黑豆皮花色苷提取工藝的研究

盧春曉，吳朝霞，*，徐亞平，張璇，何思，許瀟涵

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161；2.朝陽工程技術(shù)學(xué)校食品學(xué)院，遼寧 朝陽 122000）

黑豆（Semen glycine）又稱櫓豆、料豆、零烏豆，是虎耳草科小灌木，全國各地均有栽培，是一種黑色皮的特殊大豆品種。黑豆不僅富含豐富的營養(yǎng)元素，而且還有一定的功能性成分[1]。在中國民間，“醋泡黑豆”是一種經(jīng)過實(shí)踐的驗(yàn)證獲得了廣泛認(rèn)可的保健食品資源，具有軟化血管、改善心血管系統(tǒng)功能、降血壓、止咳、補(bǔ)腎益氣等功效[2]，但其功效成分的組成、生理功效和劑量-效應(yīng)關(guān)系等問題還未能經(jīng)過科學(xué)的、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)驗(yàn)證[3]。采用乙酸超聲波法提取黑豆皮中花色苷[4]，在單因素基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析方法進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化[5]，以期為黑豆皮色素的深入研究、開發(fā)新保健食品資源及發(fā)展食療養(yǎng)生提供必要的參考。

1 儀器、材料與試劑

1.1 材料與試劑

烏皮黃仁黑豆：沈陽新帝食品有限公司提供。

1.2 儀器

VIS-7220G型分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司；PHS-25數(shù)顯pH計(jì)：上海雷磁精密儀器廠；電子分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水?。簢A電器有限公司；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海博通儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料的預(yù)處理

將黑豆人工剝皮，將皮烘干至恒重，粉碎，過40目篩后備用。

1.3.2 黑豆皮色素吸收峰的測(cè)定

稱取0.5 g黑豆皮粉和3.5%乙酸水溶液50 mL，混合后于60℃水浴浸提30 min，將浸提液過濾，稀釋到適當(dāng)濃度，用分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描[6]，測(cè)其特征吸收光譜。

1.3.3 黑豆皮提取液中的色素測(cè)定[7]

從1.3.2中制備的待測(cè)液中吸取1.0 mL，用pH 1.0的HCl-KCl緩沖溶液定容至10 mL，以HCl-KCl緩沖溶液為參比液，在最大吸收波長512 nm處測(cè)定吸光值，以吸光值等于1為1個(gè)花色苷單位。多次浸提黑豆皮，直至浸提液無色，分別收集各次色素提取液，合并各次提取液，得到總體積（%）和總吸光度值。

1.4 黑豆皮中花色苷的超聲波萃取法提取工藝的研究

1.4.1 黑豆皮中花色苷超聲波法單因素試驗(yàn)

1.4.1.1 超聲波功率對(duì)黑豆皮花色苷提取效果的影響

在液料比10∶1，乙酸濃度10%，提取25℃，20 min條件下，研究超聲波頻率分別為 60、70、80、90、100 W時(shí)對(duì)黑豆皮花色苷提取效果的影響。

1.4.1.2 溶劑提取濃度對(duì)黑豆皮花色苷提取效果的影響

在液料比 10∶1，提取溫度 25 ℃，提取 45 min，研究乙酸濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%時(shí)對(duì)黑豆皮花色苷提取效果的影響。

1.4.1.3 提取液料比對(duì)黑豆皮花色苷提取效果的確定

在乙酸濃度為30%，提取溫度30℃條件下，研究液料比分別為 8∶1、9∶1、10∶1 時(shí)對(duì)黑豆皮花色苷提取效果的影響。

1.4.1.4 提取溫度對(duì)黑豆皮花色苷提取效果的影響

在乙酸濃度為30%，液料比為10∶1，提取時(shí)間45 min條件下，研究在20、30、40、50℃下對(duì)黑豆皮花色苷提取效果的影響。

1.4.1.5 提取時(shí)間對(duì)黑豆皮花色苷提取效果的影響

加入濃度30%的乙酸，液料比10∶1，在30℃，時(shí)間10、20、30 min下對(duì)黑豆皮花色苷提取效果的影響。

1.4.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

利用單因素試驗(yàn)結(jié)果，以超聲波功率、乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度等5個(gè)因素，使用Design-ExpertSoft-are6.0軟件設(shè)計(jì)29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)[8]。試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平因素見表1。

表1 超聲波萃取法提取黑豆皮中花色苷的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平因素Table 1 Ultrasonic wave extraction method withdraws in the black dried bean curd the variety glucoside response to interview examines the design horizontal factor

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豆皮色素含量的測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，黑豆皮色素的吸收峰在512 nm處；以黑豆皮色素溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作出黑豆皮色素含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：y＝0.9636x-0.0268，R2=0.9995，線性關(guān)系良好。結(jié)果見圖1。

圖1 黑豆皮色素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of anthocyanins in black soybean hull

2.2 超聲波萃取法提取黑豆皮中花色苷的提取工藝研究

2.2.1 超聲波法提取黑豆皮中花色苷的影響因素研究

2.2.1.1 超聲波功率對(duì)黑豆皮中花色苷提取效果的影響超聲波功率對(duì)黑豆皮中花色苷提取效果的影響，

見圖2。

圖2 超聲功率對(duì)黑豆皮中花色苷提取的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction of anthocyanins in black soybean hull

從圖2可以看出，隨著超聲波功率的提高，吸光度值有所增大，在90 W時(shí)達(dá)到峰值后，吸光度值開始慢慢變小。如果超聲波功效太小，細(xì)胞破碎不完全，花色苷釋放不完全；而功率太大時(shí)，會(huì)在提取時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生并聚集大量的熱量，破壞花色苷的結(jié)構(gòu)，不利于花色苷的提取[9]。所以90 W條件下的提取效果較佳。

2.2.1.2 提取濃度對(duì)黑豆皮中花色苷提取效果的影響

提取濃度對(duì)黑豆皮中花色苷提取效果的影響，見圖3。

圖3 提取濃度對(duì)黑豆皮中花色苷提取的影響Fig.3 Effect of solvent concentration on extraction of anthocyanins in black soybean hull

由圖3可見，濃度的大小直接影響吸光度的大小。乙酸濃度由10%到30%范圍內(nèi)吸光度值隨著濃度的增大而增大；而后隨著濃度的逐漸上升，吸光度值緩慢下降。醋酸是一種揮發(fā)性酸，濃度過高，極性也隨之發(fā)生變化，反而不利于花色苷的溶解和提取[10]。因此當(dāng)提取濃度為30%左右時(shí)，可達(dá)到較為理想的花色苷提取效果。

2.2.1.3 液料比對(duì)黑豆皮中花色苷提取效果的影響

液料比對(duì)黑豆皮中花色苷提取效果的影響，見圖4。

圖4 液料比對(duì)黑豆皮中花色苷提取的影響Fig.4 Effect of ratio of solvent and material on extraction of anthocyanins in black soybean hull

從圖4中可以看出，吸光度值隨著料液比的增大而增大，乙酸和黑豆皮色素的比例越大色素中有效成分溶解越多，因?yàn)槿軇┯昧窟_(dá)到一定程度時(shí)，花色苷已基本全部溶出[11]，再增加溶劑用量也不會(huì)有更好的效果，反而會(huì)浪費(fèi)原料并給后續(xù)的純化、干燥等工藝增加困難。因此，在本試驗(yàn)中，液料比為10∶1時(shí)的提取效果較為理想。

2.2.1.4 提取溫度對(duì)黑豆皮中花色苷提取效果的影響

提取溫度對(duì)黑豆皮中花色苷提取效果的影響，見圖5。

圖5 提取溫度對(duì)黑豆皮中花色苷提取的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction of anthocyanins in black soybean hull

從圖5中可以看出，溫度由低升高時(shí)吸光度值先增大后減少，當(dāng)溫度升到30℃吸光度值達(dá)到最大值。這主要是由于超聲波的空化作用本身會(huì)在局部產(chǎn)生高溫高壓[12]，雖然本試驗(yàn)總體提取溫度都不是很高，但由于是在超聲波輔助提取的條件下，也會(huì)或多或少影響花色苷的穩(wěn)定性，因此吸光度會(huì)有所下降。

2.2.1.5 提取時(shí)間對(duì)黑豆皮中花色苷提取效果的影響

提取時(shí)間對(duì)黑豆皮中花色苷提取效果的影響，見圖6。

圖6 提取時(shí)間對(duì)黑豆皮中花色苷提取的影響Fig.6 Effect of time on extrction anthocyanins in black soybean hull

從圖6可以看出，隨著時(shí)間的增加，吸光值逐漸呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間到達(dá)30 min以后，吸光值基本保持不變。主要是因?yàn)槌晻r(shí)間較短時(shí)，花色苷不易溶出[13]，從節(jié)省能源的角度考慮，提取時(shí)間在30 min提取效果最佳。

2.2.2 多因素響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2.1 超聲波響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

超聲波響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析，見表2。

表2 超聲波萃取黑豆皮中花色苷的響應(yīng)面數(shù)據(jù)表Table 2 Ultrasonic extraction of anthocyanins from black hull by response surface methodology

續(xù)表2 超聲波萃取黑豆皮中花色苷的響應(yīng)面數(shù)據(jù)表Continue table 2 Ultrasonic extraction of anthocyanins from black hull by response surface methodology

由上述結(jié)果，經(jīng)分析，花色苷吸光度的數(shù)學(xué)模型如下：

吸光度=-2.96434+0.055844×A+（7.40017E-003）×B+0.19761×C+0.019187×D+0.022359×E-（1.67857E-005）×A×B+（1.00000E-004）×A×C-（3.75000E-005）A×D+（9.16667E-006）×A×E+（1.37143E-004）×B×C-（1.14286E-005）×B×D-（3.33333E-006）×B×E+（7.20000E-004）×C×D-（2.13333E-004）×C×E-（4.11111E-005）×D×E－（3.61615E－004）×A2－（8.39966E－005）×B2－0.016543×C2－（3.06944E－004）×D2－（4.60648E－004）×E2

式中：A為超聲波功率，W；B為乙酸濃度，%；C為液料比，（mL/g）；D 為浸提溫度；E 為浸提時(shí)間，min。

通過方差分析，模型的P<0.01，響應(yīng)面回歸模型達(dá)到顯著水平[14]。逐項(xiàng)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波的功率、乙酸濃度、液料比、浸提溫度、浸提時(shí)間相互作用對(duì)黑豆中花色苷提取影響顯著。超聲波乙酸提取黑豆皮中花色苷的最佳工藝參數(shù)為超聲波功率90 W，乙酸濃度30%，液料比10∶1，提取溫度30℃，提取時(shí)間為30 min，得率預(yù)測(cè)值為0.659%；在該條件下，黑豆皮中花色苷提取率驗(yàn)證值為0.575%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.084%。

3 討論

近年來，超聲波輔助提取方法在天然產(chǎn)物研究中已經(jīng)得到了越來越廣泛的應(yīng)用[15]?；ㄉ疹惖某煞衷谘酢⒐庹?、較高溫度下通常不夠穩(wěn)定[16]，因此在提取技術(shù)上，為保證有效成分不破壞、不分解，對(duì)技術(shù)有特殊的要求。超聲波萃取時(shí)處理溫度較低，可有效控制那些具有熱不穩(wěn)定性功效成分的分解損失；通過促使細(xì)胞破壁，可有效提高功效成分的提取率；超聲波處理另一優(yōu)勢(shì)是作用時(shí)間較短，本試驗(yàn)中超聲波萃取30min即可獲最佳提取率，僅為水煮、醇沉法的三分之一或更少，在實(shí)際生產(chǎn)中具有重要的意義；此外，超聲波萃取還具有安全性好、操作簡單易行、維護(hù)保養(yǎng)方便、萃取效率高、適用性廣、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，是一項(xiàng)具有廣闊前景的應(yīng)用技術(shù)之一。

超聲波輔助提取中，如能與酶共同作用，可能會(huì)更有利于花色苷的充分溶出，而本試驗(yàn)提取的溫度較為接近酶的適宜作用溫度，可能會(huì)有效提高花色苷的提取率，有待進(jìn)一步研究。該試驗(yàn)同時(shí)也為我國傳統(tǒng)“醋泡黑豆”中活性成分的研究提供了一定的參考。

4 結(jié)論

以超聲波輔助提取黑豆皮花色苷色素的工藝中，超聲波功率、乙酸溶液的濃度、提取時(shí)間、提取溫度、液料比等因素均對(duì)花色苷提取率有一定的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過二次回歸設(shè)計(jì)得到了黑豆皮中花色苷乙酸超聲波提取率與超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間、液料比關(guān)系的回歸模型，經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型是合理可靠的，能夠較好的預(yù)測(cè)黑豆皮中花色苷的超聲提取率。利用模型的響應(yīng)面及其等高線，對(duì)影響黑豆皮中花色苷超聲提取的關(guān)鍵因素及其相互作用進(jìn)行探討，超聲波乙酸提取黑豆皮中花色苷的最佳工藝參數(shù)為超聲波功率90 W，乙酸濃度30%，液料比10∶1，提取溫度30℃，提取時(shí)間為30 min，得率預(yù)測(cè)值為0.659%；在該條件下，黑豆皮中花色苷提取率驗(yàn)證值為0.575%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.084%。

[1]董李平,吳珍齡.黑豆皮醇提物清除自由基效果的研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002(5):445-449

[2]崔堂兵,石漫瑩,郭勇,等.銀杏黃酮的提取與大孔樹脂吸附研究[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2002,21(4):265,269

[3]曹小勇,李新生.黑米花色素甙類色素研究現(xiàn)狀及展望[J].氨基酸和生物資源,2002,24(1):3-6

[4]陳在新,李俊凱,陳義全.分光光度法測(cè)定板栗黃酮含量[J].果樹學(xué)報(bào),2003,20(2):149-151

[5]戴啟廣,陳國平,王幸宜.新型甜味耕一二氫查爾酮衍生物[J].精細(xì)化工中間體,2004,34(3)7-9

[6]王海堂.黑豆色素的提取工藝、理化性質(zhì)研究和應(yīng)用[J].洛陽工學(xué)院報(bào),1998(6):213-216

[7]劉小玲,許時(shí)嬰,王璋.火龍果色素的基本性質(zhì)及結(jié)構(gòu)鑒定[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào),2003,22(3):62-65

[8]夏明,杜琪珍.天然紅色素研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2002(6):38-41

[9]Bermfldez-Soto M J,Tomas-Bfll-bcm F A.Evaluation of Commercial Red Fruit Juice Concentrates as Ingredients for Antioxidant Functional Juice[J].European food research and technology,2004(2):133-141

[10]徐淵金,杜琪珍.花色苷分離鑒定方法及其生物活性[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2006(3):66-67

[11]Robak J,Grgglewesik R J.Flavonoids as Scavengers of Superoxide Anion[J].Biochem Pharmacol,1988(37):837-841

[12]Hsieh R J G,Kinsella.Antioxidant:Flavonoids in Adv[J].Food Nutr Res,1989(33):233-241

[13]張萍,王玉珠,李紅寧.蕎麥中生物類黃酮的提取方法研究[J].食品研究與開發(fā),2006(2):45-47

[14]周如梅.超臨界萃取技術(shù)在天然產(chǎn)物中的應(yīng)用[J].企業(yè)技術(shù)開發(fā),2005(7):15-17

[15]趙伯濤,錢驊,張衛(wèi)明,等.黑莓榨汁殘?jiān)谢ㄉ氐奶崛〖兓⒎€(wěn)定性及功能研究[J].食品科學(xué),2005(9):157-159

[16]Hus Qin S R J,Cillard P C.cillard.Hydroxyl Scavenging Activity of flavonoids[J].lbid,1987(26):2487-2491