氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測分析六大蒸餾酒中揮發(fā)性成分差異

宋丹丹，何鵬輝，陳 娟，楊 亮

（1.茅臺學(xué)院 釀酒工程系，貴州 仁懷 564501；2.湖北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062；3.茅臺學(xué)院 食品工程系，貴州 仁懷 564501）

含酒精飲料是人類文明的一部分。在文明的發(fā)展過程中，世界各地出現(xiàn)了多種蒸餾酒，它們在發(fā)展過程中形成了自己獨特的釀酒工藝?，F(xiàn)普遍認為世界蒸餾酒有六種代表性產(chǎn)品，包括以高粱、小麥等谷物為原料的中國白酒[1]；以葡萄或其他水果為原料的白蘭地[2]；以谷物及大麥芽為原料的威士忌[3]；以甘蔗或糖蜜為原料的朗姆酒[4]；以糧谷和薯類為原料經(jīng)發(fā)酵、蒸餾得到的食用酒精為原料的伏特加[5]和以糧谷為原料經(jīng)發(fā)酵、蒸餾得到食用酒精串香杜松子的金酒[6]。六大蒸餾酒各有獨特的風(fēng)格，這些酒的風(fēng)格特征和品質(zhì)取決于其揮發(fā)性香味物質(zhì)的成分、含量及其量比關(guān)系[7-8]。

由于使用不同的原料、生產(chǎn)工藝和貯存條件，這些蒸餾酒中的化合物可能有所不同。如大多數(shù)西方蒸餾酒用純種酵母發(fā)酵，而中國白酒的發(fā)酵是由多種微生物（細菌、酵母、絲狀真菌等）共同完成的[9-11]。此外，中國白酒是通過固態(tài)釀造，而西方蒸餾酒則是液態(tài)釀造。因此，中國白酒和西方白酒在成分特征方面具有較大差異[12]。

本研究利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）技術(shù)對6種蒸餾酒（中國白酒（醬香型）、威士忌、白蘭地、伏特加、朗姆酒和金酒））中的揮發(fā)性物質(zhì)進行了分離和鑒定，在主成分分析（principal component analysis，PCA）的基礎(chǔ)上，進一步分析比較6種蒸餾酒間揮發(fā)性物質(zhì)差異，比較了不同蒸餾酒中化學(xué)成分，對充分認識蒸餾酒風(fēng)格的實質(zhì)具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無水硫酸鈉、丙酮（均為分析純）：國藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）：美國Thermo Fisher Scientific公司；6種蒸餾酒酒樣（S1中國白酒，酒精度43%vol；S2威士忌，酒精度40%vol；S3白蘭地，酒精度40%vol；S4伏特加，酒精度40%vol；S5朗姆酒，酒精度40%vol；S6金酒，酒精度40%vol）：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E萬分之一天平：瑞士梅特勒-托利多國際有限公司；Trace1300氣相色譜-TSQ8000質(zhì)譜聯(lián)用儀（AI1310自動進樣器）：美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 酒樣前處理

將實驗酒樣樣本各取3份，每份2 mL，加入2 g無水硫酸鈉，混勻，4 ℃靜置24 h；隨后4 ℃、14 000 r/min離心5 min；取800 μL上清液使用0.22 μm有機濾膜過濾至氣相瓶中；采用GC-MS檢測。

1.3.2 色譜與質(zhì)譜檢測條件

氣相色譜參數(shù)如下：色譜柱TG-WAXMS（0.25 μm，30 m×0.25 mm）；進樣口溫度250 ℃，進樣量1 μL，載氣為氦氣（N2），流速1.2 mL/min，采用不分流進樣；升溫程序為初始溫度50 ℃保持1 min，6 ℃/min升至230 ℃，保持15 min，分析時間為45 min。

質(zhì)譜參數(shù)如下：全掃模式，離子源為電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，傳輸線溫度230 ℃，離子源溫度250 ℃，掃描范圍為35～600 m/z，溶劑滯留時間5 min。

1.3.3 定性和定量分析方法

定性分析方法：將經(jīng)過分析得到的氣相色譜圖與質(zhì)譜離子碎片圖譜和美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）數(shù)據(jù)庫中的標準圖譜進行比對，正反匹配率＞800的表示定性準確。

定量分析方法：利用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀自帶數(shù)據(jù)處理軟件TraceFinder 4.1進行峰提取和峰對齊，利用特征峰對每個物質(zhì)進行定量分析，采用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用TraceFinder 4.1進行峰提取和峰對齊操作，計算每個物質(zhì)的相對含量；利用SIMCA 14進行主成分統(tǒng)計分析和差異分析；利用Microsoft Excel 2016和SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)處理并計算P值，P＜0.05為差異顯著。每種酒樣3個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酒樣中揮發(fā)性物質(zhì)主成分聚類分析

不同來源酒樣中的揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)GC-MS檢測后的總離子流色譜圖如圖1所示，由于溶劑峰較高，容易干擾檢測線，因此從第5分鐘開始監(jiān)測揮發(fā)性物質(zhì)的出峰情況。

圖1 6種不同酒樣中揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ions chromatogram of volatile compounds in six different spirits samples analysis by GC-MS

從圖1可知，中國白酒（醬香型）的揮發(fā)性物質(zhì)種類比其他酒樣要多，且物質(zhì)出峰的離子強度遠高于其他酒樣。其次是白蘭地，揮發(fā)性物質(zhì)種類也比較多，高于威士忌、伏特加、朗姆酒和金酒。6種酒樣中一共有85種物質(zhì)被檢測到，與NIST數(shù)據(jù)庫進行比對分析后，有79種物質(zhì)能夠被精確定性。將6種酒樣中被定性出的揮發(fā)性物質(zhì)進行組成種類分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，中國白酒（醬香型）中酯類物質(zhì)、酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)的種類均高于其他酒樣，這也是中國白酒（醬香型）比其他種類酒的香味更濃、更醇厚的原因之一[7]；另外，中國白酒（醬香型）中的酮類物質(zhì)種類相對較少，而威士忌、白蘭地和伏特加中的酮類物質(zhì)較多。酒樣中酮類物質(zhì)大多是呋喃酮及其衍生物，其中呋喃酮具有濃郁的香味，且閾值較低，對酒體風(fēng)味具有重要貢獻[13-14]。雖然中國白酒（醬香型）中酮類物質(zhì)較少，但中國白酒（醬香型）中的乙偶姻（3-羥基-2-丁酮）的含量相對較高，賦予白酒奶油香味[15-16]。酮類物質(zhì)及種類的差異也是造成西方蒸餾酒與中國白酒（醬香型）風(fēng)味差異的主要因素。其次，中國白酒（醬香型）中的呋喃類化合物種類明顯高于其他酒，呋喃類化合物給酒體帶來溫和香味[17-19]；朗姆酒和金酒的揮發(fā)性成分較少，且含量較低，酸類物質(zhì)占比較大，這可能是朗姆酒和金酒較為辛辣的原因之一。由于這些揮發(fā)性物質(zhì)種類的差異，造成了中國白酒（醬香型）與其他蒸餾酒風(fēng)味上的差異。中國白酒（醬香型）中還含有其他酒均不存在的吡嗪類物質(zhì)[20-21]。在中國白酒（醬香型）的釀造過程中，芽胞桿菌代謝生成的乙偶姻在高溫條件下會自發(fā)形成四甲基吡嗪及其衍生物[22]。

圖2 不同酒樣中揮發(fā)性物質(zhì)組成差異Fig.2 Differences in volatile compounds between different spirits samples

主成分分析（principal component analysis，PCA）是考察多個變量間相關(guān)性的一種行之有效的多元統(tǒng)計方法。本研究采用SIMCA 14對酒樣進行主成分分析，結(jié)果如圖3A所示。將六種酒的揮發(fā)性成分進行統(tǒng)計分析后，樣品S1（中國白酒）與樣品S3（白蘭地）差異明顯，S2（威士忌）、S4（伏特加）、S5（朗姆酒）和S6（金酒）無明顯差異，但與S1和S3差異明顯。

進一步將S1和S3單獨進行差異分析，結(jié)果如圖3B所示，樣品S1和S3有很明顯差異。將沒有明顯差異的樣品S2、S4、S5和S6進行主成分分析，結(jié)果（圖3C）顯示，樣品S2與S4，S5、S6均具有明顯差異，S5和S6沒有明顯差異，進一步將S5和S6進行分析，S5和S6有明顯差異（圖3D）。

圖3 不同酒樣中揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析Fig.3 Principal components analysis of volatile compounds in different spirits samples

結(jié)合圖2和圖3分析，可發(fā)現(xiàn)樣品S1和S3之間的顯著差異主要是由于物質(zhì)含量上的差異造成的，而并非由于揮發(fā)性成分的組成結(jié)構(gòu)，S2和S4、S5和S6亦是如此。但是樣品S1、S3和樣品S2、S4、S5、S6之間的差異則主要是由于揮發(fā)性物質(zhì)種類差異造成的，樣品S1和S3、S2和S4、S5和S6種類相差不大，說明六種酒中揮發(fā)性物質(zhì)的差異不僅與揮發(fā)性成分的種類相關(guān)，而且與揮發(fā)性物質(zhì)成分的含量有關(guān)。

2.2 不同來源酒樣中揮發(fā)性物質(zhì)差異分析

將5種西方蒸餾酒作為一類樣品，與中國白酒（醬香型）中的揮發(fā)性物質(zhì)進行比較，結(jié)果如圖4、圖5及表1所示。中國白酒（醬香型）與西方蒸餾酒在揮發(fā)性物質(zhì)種類上有明顯的差異，其中有27種揮發(fā)性物質(zhì)是相同的，同時中國白酒（醬香型）有29種特有的物質(zhì)，而西方蒸餾酒中有22種特有的物質(zhì)。

圖4 醬香型白酒和西方蒸餾酒在揮發(fā)性成分種類上的異同F(xiàn)ig.4 Similarities and differences in types of volatile components of sauce-flavor Baijiu and western distilled spirits

對于醇類物質(zhì)，西方蒸餾酒中的高級醇種類明顯多于中國白酒（醬香型），特別是含有10碳的芳樟醇和4-萜烯醇。芳樟醇和4-萜烯醇都是萜烯醇類化合物，其中芳樟醇氣味純正清甜，能賦予蒸餾酒花香、水果香等風(fēng)味[23]；4-萜烯醇則賦予蒸餾酒較淡的土香和木香[24]。芳樟醇和4-萜烯醇在西方蒸餾酒揮發(fā)性醇類成分中所占比例較大，其中金酒中的醇類成分僅有這兩種醇，是金酒風(fēng)味的主要貢獻者。此外，具有甜香、玫瑰花香和蜂蜜香等氣味的苯乙醇[25-26]，它在中國白酒（醬香型）、威士忌、白蘭地、伏特加和朗姆酒等酒中都存在，是重要的香氣成分，且中國白酒（醬香型）中的苯乙醇含量遠高于其他蒸餾酒（表1）。

其次，六大蒸餾酒的酸類物質(zhì)差異較大。中國白酒（醬香型）中酸類物質(zhì)的種類與含量均高于西方蒸餾酒，其中乙酸是所有酒中含量和占比最大的酸類化合物，中國白酒（醬香型）和白蘭地酒樣中乙酸含量較為接近，且均高于其他酒樣；另外，由圖5和表1可以看出，中國白酒（醬香型）中6碳以下的低級脂肪酸占比較高，而西方蒸餾酒中6碳以上的高級脂肪酸占比較高。

中國白酒（醬香型）與西方蒸餾酒的另一大類物質(zhì)區(qū)別是酯類物質(zhì)，酸和醇在發(fā)酵過程中經(jīng)生化反應(yīng)形成了各種酯類，其中乙酯是酒中酯類的主體成分，脂肪酸乙酯無論從數(shù)量上還是種類上都占絕大多數(shù)。含碳數(shù)在10以下的脂肪酸乙酯有香氣，12個碳以上的高級脂肪酸乙酯幾乎無氣味[27-28]。中國白酒（醬香型）中乳酸乙酯和棕櫚酸乙酯占酯類物質(zhì)的大部分，而這兩種酯類化合物在西方蒸餾酒幾乎檢測不到。另外，西方蒸餾酒樣中10碳以下的脂肪酸酯含量較多，而中國白酒（醬香型）中的棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯等高級脂肪酸含量較高，這也是西方蒸餾酒和中國白酒（醬香型）風(fēng)味差異的主要原因之一。

圖5 醬香型白酒和西方蒸餾酒在揮發(fā)性成分含量上的差異Fig.5 Differences in of contents of volatile components of sauce-flavor Baijiu and western distilled spirits

表1 醬香型白酒和西方蒸餾酒揮發(fā)性物質(zhì)含量的差異分析Table 1 Analysis of the differences in volatile matter contents between sauce-flavor Baijiu and western distilled spirits

續(xù)表

圖6 醬香型白酒揮發(fā)性物質(zhì)含量測定Fig.6 Determination of volatile compound contents in sauce-flavor Baijiu

羰基化合物是另一大類在六大蒸餾酒揮發(fā)性成分差異較大的物質(zhì)。西方蒸餾酒中酮類化合物的種類數(shù)量遠遠高于中國白酒（醬香型）（如圖2和圖4所示）。雖然本研究只在中國白酒（醬香型）中檢出一種酮類物質(zhì)，但其含量與白蘭地中總酮類物質(zhì)含量接近，且遠高于其他蒸餾酒（P＜0.01）。酮類化合物含量，在中國白酒（醬香型）揮發(fā)性物質(zhì)中所占比例低于西方蒸餾酒，因此在酒的風(fēng)味中酮類物質(zhì)對西方蒸餾酒的貢獻可能大于中國白酒（醬香型）。由圖6可知，對于醛類化合物，中國白酒（醬香型）的糠醛含量很高，其含量僅次于乳酸乙酯和2,3-丁二醇。糠醛是中國白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，其含量越高，酒味越香醇[29]，特別是中國醬香型白酒獨特的高溫發(fā)酵工藝，促進了糠醛的生成。另外，苯甲醛只在中國白酒（醬香型）中檢出，苯甲醛是最簡單的芳香醛，賦予中國白酒（醬香型）杏仁香氣[30]。而5-羥甲基糠醛和香草醛只在西方蒸餾酒中檢出，其中5-羥甲基糠醛存在于威士忌、白蘭地、伏特加和朗姆酒中，且白蘭地中含量最高[31]；香草醛（3-甲氧基-4-羥基苯甲醛）僅在白蘭地中檢測出來，是在其陳釀過程中由橡木桶溶出，賦予酒體獨特的香氣[32-33]。

對于呋喃類化合物，2-乙酰呋喃僅存在于中國白酒（醬香型）中，2-乙酰呋喃具有杏仁、堅果、酵香、牛奶和焦糖香[18]，是中國白酒（醬香型）重要的風(fēng)味物質(zhì)之一。而2,5-二甲醛呋喃在六大蒸餾酒中均存在，在白蘭地中含量最高（見表1），目前尚未見2,5-二甲醛呋喃在氣味上的報道。

3 結(jié)論

本研究為了更好的保留酒樣中的成分，采取了除水后直接進樣的方式對酒樣中的揮發(fā)性成分進行了檢測，在強極性色譜柱TG-WAXMS的分離下，在六大蒸餾酒中一共檢測到了85種物質(zhì)，其中有79種被精確定性。主成分分析（PCA）結(jié)果顯示，六大蒸餾酒之間的揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量均具有顯著差異，進一步進行差異分析發(fā)現(xiàn)，相比于西方蒸餾酒，中國白酒（醬香型）的香味成分具有酸高、酯高、醛酮高、高級醇低等特征。

對六大蒸餾酒的揮發(fā)性物質(zhì)種類進行統(tǒng)計分析，中國白酒（醬香型）與西方蒸餾酒在揮發(fā)性物質(zhì)種類上有明顯差異，其中29種物質(zhì)只在中國白酒（醬香型）中檢出，而有22種物質(zhì)只在西方蒸餾酒中檢出。中國白酒（醬香型）與西方蒸餾酒在風(fēng)格上的極大差異可能受到許多因素影響，包括原材料、生產(chǎn)工藝、微生物和不同貯存容器，也正是由于這些差異造就了不同的酒體風(fēng)格。對中國白酒（醬香型）和西方蒸餾酒在揮發(fā)性物質(zhì)上的差異研究，有助于深入了解六大蒸餾酒的揮發(fā)性物質(zhì)差異，為酒體的質(zhì)量評估奠定基礎(chǔ)。