HPLC法快速檢測(cè)黑糯米酒中有機(jī)酸含量

王洪琳，蘇 偉，母應(yīng)春，姜 麗，趙 馳

（貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

酸是酒中重要的呈味物質(zhì)，有機(jī)酸在酒的口感和風(fēng)味中起著關(guān)鍵作用[1]，其含量直接影響黑糯米酒的口感[2]，含量過低，導(dǎo)致酒體平淡無味，過高則使酒體生硬粗澀，是酒中酸味的主要承擔(dān)者，與其他呈味化合物共同組成酒特有的芳香，具有一定的呈香、呈味作用。此外，有機(jī)酸還可以溶解酒中色素，使酒的顏色更加純凈美觀[3]，且適量的有機(jī)酸能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，降低黑糯米酒的甜度，增強(qiáng)黑糯米酒的濃香，還能在貯藏過程中促進(jìn)酯類物質(zhì)形成[4]。由于釀造工藝和釀造原料的不同，使得黑糯米酒中主要有機(jī)酸種類和含量有一定的差異。因此，對(duì)黑糯米酒中主要有機(jī)酸進(jìn)行測(cè)定，明確黑糯米酒中有機(jī)酸種類和含量對(duì)調(diào)整黑糯米酒的口味和提高酒的質(zhì)量尤為重要[5-6]。

目前有機(jī)酸的測(cè)定常采用氣相色譜法（gas chromatography，GC）[7]、酸堿滴定法[8]、離子色譜（ion chromatography，IC）法[9-11]、紅外光譜（infrared spectrum，IRS）法[12]和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[13]等。其中HPLC法準(zhǔn)確度高、樣品前處理簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好，且操作簡(jiǎn)單，可同時(shí)測(cè)定多種有機(jī)酸，已得到廣泛應(yīng)用[14]。但在實(shí)際檢測(cè)中，由于使用儀器和色譜柱型號(hào)的差異，測(cè)定方法和色譜條件也有所相同。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)黑糯米酒中有機(jī)酸含量的測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

11種黑糯米酒（依次編號(hào)為HMJ1～HMJ11，HMJ1福建龍巖；HMJ2、HMJ3廣東梅州；HMJ4、HMJ5廣東河源；HMJ6、HMJ7陜西洋縣；HMJ8貴州清鎮(zhèn)；HMJ9、HMJ10、HMJ11貴州惠水）：市售。磷酸二氫鈉、酒石酸（均為分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二銨、乳酸、草酸、檸檬酸、磷酸（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；丙酮酸、L-蘋果酸、α-酮戊二酸、焦谷氨酸、琥珀酸（均為分析純）：麥克林生化科技有限公司；甲醇（色譜純）：河北百靈威超精細(xì)材料有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1260高效液相色譜儀（配置G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1311C四元低壓泵、G1316A柱溫箱、G1315D二極管陣列檢測(cè)器，ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm））：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

樣品處理：同時(shí)將樣品未處理、活性炭處理和離心處理，過0.22 μm濾膜后上機(jī)發(fā)現(xiàn)測(cè)試結(jié)果差異不顯著，故不對(duì)樣品進(jìn)行處理，直接取樣過0.22 μm水系濾膜后待上機(jī)。

有機(jī)酸混標(biāo)的配制：分別稱取草酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、焦谷氨酸、蘋果酸各0.050 g，酒石酸、琥珀酸各0.10 g，乳酸0.42 g，乙酸1.05 g，用蒸餾水溶解后于100 mL容量瓶定容至刻度，制成母液待用。

1.3.2 色譜條件的優(yōu)化

取有機(jī)酸混標(biāo)母液10 mL定容至50 mL容量瓶，在200～400 nm范圍內(nèi)對(duì)其進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在波長(zhǎng)210 nm處各有機(jī)酸峰形及吸收峰最佳，故測(cè)定波長(zhǎng)確定為210 nm。

（1）流動(dòng)相磷酸鹽的選擇

多數(shù)緩沖液在波長(zhǎng)210 nm附近有較強(qiáng)的吸收，磷酸鹽緩沖液是最典型、最適合的緩沖液，其在紫外區(qū)幾乎無吸收，可以提高檢測(cè)的靈敏度，因此選擇磷酸鹽作為有機(jī)酸分析的流動(dòng)相。分別配制0.02 mol/L的磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉及磷酸氫二銨溶液，調(diào)節(jié)pH值為2.90；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)器：G1315D；ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱溫：35 ℃；流速：0.00～4.00 min，流速為1.0 mL/min；4.00～10.00min為0.30mL/min；10.00min后流速為1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

（2）流動(dòng)相濃度的選擇

緩沖液濃度的高低影響溶液的離子強(qiáng)度及有機(jī)酸在流動(dòng)相中的存在形式，從而影響色譜柱對(duì)有機(jī)酸的分離效果，其濃度越高，待測(cè)有機(jī)酸的存在形式越穩(wěn)定。但其濃度又不宜過高，濃度升高會(huì)增大離子強(qiáng)度，對(duì)組分分離不利，同時(shí)還影響柱子和泵的使用壽命，從而降低檢測(cè)靈敏度。所以配制磷酸二氫鈉溶液的濃度為0.01 mol/L、0.02 mol/L和0.03 mol/L，調(diào)節(jié)pH值為2.90，其他條件不變，探討不同濃度磷酸二氫鈉作為流動(dòng)相對(duì)各有機(jī)酸保留時(shí)間及分離效果的影響。

（3）流動(dòng)相pH值的選擇

因有機(jī)酸屬于弱酸，在溶液中的解離程度受溶液pH控制，提高緩沖液H+濃度，有機(jī)酸解離平衡則傾向分子態(tài)，從而增加有機(jī)酸在色譜柱上的保留，各有機(jī)酸因其分配系數(shù)不同而被分離。故配制pH值為2.50、2.70、2.90和3.10，濃度為0.03mol/L的磷酸二氫鈉溶液。其他條件不變，分析不同pH的磷酸二氫鈉溶液對(duì)各有機(jī)酸保留時(shí)間及分離效果的影響。

（4）柱溫的選擇

流動(dòng)相的黏度和傳質(zhì)效率受色譜柱柱溫影響，柱溫升高，流動(dòng)相的黏度下降，傳質(zhì)效率提高，使得待測(cè)物質(zhì)保留時(shí)間縮短，但柱溫過高不利于組分的分離且影響色譜柱使用壽命。因此選擇柱溫為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，濃度為0.03 mol/L的磷酸二氫鈉溶液為流動(dòng)相，pH值2.90，其他條件不變，分析不同柱溫對(duì)10種有機(jī)酸分離效果的影響。

（5）流動(dòng)相中甲醇的比例

流動(dòng)相中甲醇的加入不僅能改善色譜峰形，還能縮短分析檢測(cè)時(shí)間，故選擇流動(dòng)相甲醇-磷酸二氫鈉的比例為0∶100、1∶99、3∶97、5∶95（V/V），探討流動(dòng)相中甲醇加入的不同比例對(duì)有機(jī)酸分離效果的影響。

1.3.3 黑糯米酒中10種有機(jī)酸的測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取有機(jī)酸混標(biāo)母液2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL于50 mL容量瓶，蒸餾水定容至刻度，過0.22 μm濾膜待用。每個(gè)濃度做3個(gè)平行，以各種有機(jī)酸的濃度為自變量，色譜峰的平均峰面積為因變量，外標(biāo)法定量。

色譜條件：流動(dòng)相為0.03 mol/L磷酸二氫鈉溶液，不加甲醇，pH2.90；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)器為G1315D；ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱溫35 ℃；流速：0～4 min，流速為1.0 mL/min；4～10 min為0.30 mL/min；10 min后流速為1.0 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

（2）黑糯米酒中10種有機(jī)酸含量的測(cè)定

直接取酒樣過0.22 μm水系膜后，按1.3.3中（1）的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 方法性能評(píng)價(jià)

（1）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按照1.3.3中（1）的色譜條件，取HMJ1樣品1.5 mL過0.22 μm濾膜后，對(duì)有機(jī)酸的峰面積進(jìn)行6次測(cè)定，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

（2）精密度實(shí)驗(yàn)

按照1.3.3中（1）的色譜條件，取1.3.2中有機(jī)酸母液1.5 mL過0.22 μm濾膜，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定10種有機(jī)酸的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

（3）加標(biāo)回收率試驗(yàn)

按照1.3.3中（1）的色譜條件，將HMJ1樣品與1.3.2中有機(jī)酸混標(biāo)按1∶1（V/V）混合后取1.5 mL過0.22 μm過濾膜后上機(jī)。同時(shí)做樣品對(duì)照。對(duì)10種有機(jī)酸進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 磷酸鹽的選擇

不同磷酸鹽對(duì)10種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液保留時(shí)間及分離效果的影響如圖1所示。

圖1 流動(dòng)相磷酸鹽種類對(duì)10種有機(jī)酸分離效果的影響Fig.1 Effect of phosphate types in mobile phase on the separation of 10 organic acids

由圖1可知，以磷酸二氫鈉作為流動(dòng)相時(shí)，10種有機(jī)酸都得到了很好的分離，對(duì)有機(jī)酸檢測(cè)得干擾小。對(duì)比圖譜可知，當(dāng)用磷酸二氫鉀和磷酸氫二銨作流動(dòng)相時(shí)，各有機(jī)酸出峰順序一致，但檸檬酸和乙酸之間的分離效果差，且雜峰對(duì)琥珀酸的影響較大。因此，本研究選擇使用磷酸二氫鈉作流動(dòng)相。

2.1.2 流動(dòng)相中磷酸鹽濃度的選擇

磷酸鹽濃度的不同，各有機(jī)酸的分離度也不同，不同濃度磷酸二氫鈉溶液對(duì)10種有機(jī)酸分離效果的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 流動(dòng)相磷酸二氫鈉濃度對(duì)10種有機(jī)酸分離效果的影響Fig.2 Effect of sodium dihydrogen phosphate concentration in mobile phase on the separation of 10 organic acids

由圖2可知，磷酸二氫鈉的濃度對(duì)于10種有機(jī)酸的峰形及分離效果均具有一定的影響，對(duì)比3個(gè)不同磷酸二氫鈉濃度的色譜圖可知，當(dāng)磷酸二氫鈉溶液得濃度升高時(shí)，10種有機(jī)酸的保留時(shí)間有所縮短，且10種有機(jī)酸的分離效果和峰形越來越好，當(dāng)磷酸二氫鈉的濃度為0.03 mol/L時(shí)，草酸峰形的后拖尾有所改善。因此，本研究選擇0.03 mol/L的磷酸二氫鈉溶液作為流動(dòng)相。

2.1.3 流動(dòng)相pH的選擇

不同pH的磷酸二氫鈉流動(dòng)相對(duì)10種有機(jī)酸保留時(shí)間及分離效果的影響如圖3所示。

由圖3可知，不同pH的流動(dòng)相對(duì)10種有機(jī)酸的分離效果、出峰時(shí)間和峰形均存在較大影響，對(duì)比不同pH的色譜圖可知，隨著流動(dòng)相中H+濃度的降低，10種有機(jī)酸的保留時(shí)間均有較大的縮短，特別是焦谷氨酸的出峰時(shí)間由8.86 min提前至7.49 min；同時(shí)，pH對(duì)檸檬酸和乙酸的出峰時(shí)間影響也較大，當(dāng)pH為2.50時(shí)，檸檬酸出峰時(shí)間在乙酸后，當(dāng)pH為2.70時(shí)，檸檬酸與乙酸出峰時(shí)間重合，難以分離，當(dāng)pH為2.90，檸檬酸在乙酸前出峰，兩者的之間分離度較好，當(dāng)pH繼續(xù)升高至3.10時(shí)，檸檬酸與乳酸出峰時(shí)間接近，分離度差，且色譜峰出現(xiàn)一定程度的拖尾現(xiàn)象。故本研究選擇磷酸二氫鈉溶液的pH為2.90。

圖3 流動(dòng)相pH值對(duì)10種有機(jī)酸分離效果的影響Fig.3 Effect of pH value of mobile phase on the separation of10 organic acids

2.1.4 柱溫的選擇

不同柱溫對(duì)10種有機(jī)酸保留時(shí)間及分離效果的影響如圖4所示。

圖4 柱溫對(duì)10種有機(jī)酸分離效果的影響Fig.4 Effect of column temperature on the separation of 10 organic acids

由圖4可知，柱溫的改變對(duì)10種有機(jī)酸分離效果的影響較大，當(dāng)柱溫為25 ℃和30 ℃時(shí)，乙酸與檸檬酸出峰時(shí)間重合，難以分開，同時(shí)乳酸與α-酮戊二酸的分離度和峰形較差。但隨著溫度的升高，10種有機(jī)酸均得到有效分離，當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，10種有機(jī)酸的分離度和峰形最佳，且噪音低。當(dāng)溫度繼續(xù)升高至40 ℃時(shí)，10種有機(jī)酸的分離度不受影響，但峰形出現(xiàn)一定程度的拖尾，其中琥珀酸的拖尾較嚴(yán)重，且溫度升高時(shí)，色譜柱損傷亦隨之增大。故本試驗(yàn)選擇的柱溫為35 ℃。

2.1.5 流動(dòng)相中有機(jī)相比例的選擇

調(diào)節(jié)甲醇和磷酸二氫鈉溶液的體積比分別為0∶100、1∶99、3∶97和5∶95（V∶V），其對(duì)10種有機(jī)酸保留時(shí)間及分離效果的影響如圖5所示。

有機(jī)相的加入不僅可以改善峰形，且對(duì)色譜柱有一定程度的保護(hù)作用，能降低流動(dòng)相的極性，縮短分析檢測(cè)的時(shí)間，由圖5可知，甲醇的加入對(duì)10種有機(jī)酸分離效果和保留時(shí)間的影響較大，隨著甲醇的加入，10種有機(jī)酸保留時(shí)間隨之提前，其分離度也受影響。當(dāng)加入3%、5%的甲醇時(shí)，蘋果酸與α-酮戊二酸、檸檬酸與乙酸不能達(dá)到相應(yīng)的分離效果，與不添加甲醇相比，峰形和噪音改善不明顯。且達(dá)不到相應(yīng)的分離效果，本實(shí)驗(yàn)的色譜柱可耐受純水相，故使用100%無機(jī)相作為流動(dòng)相不會(huì)導(dǎo)致色譜柱填料塌陷，且10種有機(jī)酸均能在10 min以內(nèi)達(dá)到基線分離，故本實(shí)驗(yàn)不加甲醇。

圖5 流動(dòng)相中甲醇比例對(duì)10種有機(jī)酸分離效果的影響Fig.5 Effect of methanol percentage in mobile phase on the separation of 10 organic acids

2.2 黑糯酒中10種有機(jī)酸含量的測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

分別以10種有機(jī)酸的濃度為自變量（x），峰面積（y）為因變量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的計(jì)算，結(jié)果見表1。

表1 10種有機(jī)酸回歸方程Table 1 Regression equations of 10 organic acids

由表1可知，10種有機(jī)酸的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999 0，由此可知10種有機(jī)酸在濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，且檢出限在0.014 9～0.219 0 mg/L之間，具有較高的靈敏度，可以滿足黑糯米酒中有機(jī)酸測(cè)定要求。

2.2.2 黑糯米酒中有機(jī)酸含量測(cè)定

按1.3.3中（1）的色譜條件對(duì)11個(gè)黑糯米酒樣品中10種有機(jī)酸測(cè)定的結(jié)果如表2所示。

由表2可知，乳酸、乙酸、酒石酸、琥珀酸和檸檬酸是主要的有機(jī)酸，這與CAO Y等[15]對(duì)黃酒中有機(jī)酸的研究結(jié)果相符。11個(gè)酒樣中只有HMJ6檢出全部10種有機(jī)酸，其余樣品中只檢測(cè)出部分有機(jī)酸，且含量各異，這可能與樣品的原料、工藝等有關(guān)。除樣品HMJ3沒有檢測(cè)出乳酸外，其余樣品均檢測(cè)出乳酸，除HMJ1、HMJ3外，乳酸含量是每個(gè)樣品中含量最高的，而HMJ3中含量最高的有機(jī)酸則是酒石酸。僅在HMJ1和HMJ6中檢測(cè)到琥珀酸，且HMJ1含量較高，琥珀酸能夠使酒體更加醇厚。黑糯米酒中的有機(jī)酸主要是由發(fā)酵過程中存在的酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌等多種微生物通過三羧酸或丙酮酸循環(huán)代謝形成。乳酸等有機(jī)酸的存在能夠緩解發(fā)酵黑糯米酒中乙酸帶來的強(qiáng)烈刺激性，從而賦予黑糯米酒酸味柔和，回味綿長(zhǎng)的口感特點(diǎn)。乳酸比較柔和，能給黑糯米酒帶來良好的風(fēng)味，其香氣雖然微弱，但由于含量較高，對(duì)黑糯米酒起到增加醇厚感的作用。同時(shí)，在異常情況下，當(dāng)發(fā)酵醪液中的乳酸桿菌和外界侵入的有害菌大量生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生過量的乳酸，致使發(fā)酵醪液的酸度上升，抑制正常酵母發(fā)酵產(chǎn)酒精，當(dāng)總酸度＞7.5 g/L時(shí)，發(fā)酵醪液的香味和口味就變壞，稱為酸敗，因此，乳酸含量對(duì)黑糯米酒的品質(zhì)起著關(guān)鍵作用，是生產(chǎn)過程中需要控制的一個(gè)重要指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)11種黑糯米酒樣品中的有機(jī)酸進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），計(jì)算各個(gè)因子得分，對(duì)樣品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出，11個(gè)樣品在第一主成分和第二主成分上勉強(qiáng)區(qū)分開，可以被分為4個(gè)區(qū)域。福建龍巖黑糯米（HMJ1）酒位于圖中PC1負(fù)方向區(qū)域；廣東梅州黑糯米酒和陜西黑米酒（HMJ2、HMJ3、HMJ6、HMJ7）位于PC1的正方向區(qū)域；廣東河源黑糯米酒位于PC2 的正方向區(qū)域；貴州黑糯米酒（HMJ9、HMJ10、HMJ11）位于PC2的正方向，主要與乳酸有相關(guān)聯(lián)，這表明乳酸可以作為貴州黑糯米酒的特征性有機(jī)酸以區(qū)分其他地域的樣品。

表2 HPLC法測(cè)定黑糯米酒中10種有機(jī)酸含量Table 2 Contents of 10 organic acids in black glutinous rice wine detected by HPLC

圖6 11種黑糯米酒樣品中有機(jī)酸主成分分析Fig.6 Principal component analysis of organic acids in 11 black glutinous rice wine samples

2.3 方法學(xué)研究

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn)

按1.3.3中（1）的色譜條件，取有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)母液10 mL于50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，過0.22 μm水系濾膜后，連續(xù)進(jìn)樣6次，同時(shí)對(duì)10種有機(jī)酸的峰面積進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值（RSD），儀器精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

由表3可知，10種有機(jī)酸的RSD均在0.60%以下，故使用本研究?jī)?yōu)化的色譜條件測(cè)定黑糯米酒中10種有機(jī)酸時(shí)具有良好的精密度。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of precision tests

2.3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取HMJ6黑糯米酒樣品6份，過0.22 μm水系濾膜后在不同時(shí)間段（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h）分別進(jìn)樣，色譜條件同1.3.3中（1），測(cè)定樣品中10種有機(jī)酸的含量，同時(shí)計(jì)算其RSD。結(jié)果如表4所示。

由表4可知，10種有機(jī)酸的RSD均在1.00%以下，因而使用該研究?jī)?yōu)化后的色譜條件測(cè)定黑糯米酒中10種有機(jī)酸具有良好重復(fù)性。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of repeatability tests

2.3.3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照1.3.3中（1）的色譜條件進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如表5所示。

表5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of standard recovery rate tests

續(xù)表

由表5可知，10種有機(jī)酸的平均回收率在94.39%～104.73%之間，表明該檢測(cè)方法準(zhǔn)確度高，因而使用本研究?jī)?yōu)化的色譜條件測(cè)定黑糯米酒中10種有機(jī)酸時(shí)可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。

通過對(duì)黑糯米酒中有機(jī)酸測(cè)定的色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了黑糯米酒中有機(jī)酸快速檢測(cè)的方法，即色譜條件：流動(dòng)相為磷酸二氫鈉溶液濃度0.03 mol/L，不加甲醇，pH值2.90；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)器為G1315D；ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱溫35 ℃；流速0～4.00 min，流速為1.0 mL/min；4.00～10.00為0.30 mL/min；10.00 min后流速為1.0 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。與楊成聰[16]建立的HPLC法測(cè)定米酒中有機(jī)酸的方法有所差異，差異主要表現(xiàn)在流動(dòng)相、流動(dòng)相濃度、柱溫、pH值的不同，可能是所用儀器類型及型號(hào)和色譜柱的不同，在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，同樣的儀器、色譜柱及相同的條件，不同型號(hào)儀器的檢出效果差異很大。同時(shí)，與之檢出的7種有機(jī)酸相比，本研究建立的方法更優(yōu)，同時(shí)檢出的有機(jī)酸種類更多（10種）。此外，與韓曉鵬[17-20]對(duì)果酒和獼猴桃酒中有機(jī)酸測(cè)定的方法比較可知，他們所建立的HPLC法測(cè)定有機(jī)酸檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)（20 min），且同時(shí)檢測(cè)有機(jī)酸種類（4種）較少，本實(shí)驗(yàn)所建立的有機(jī)酸測(cè)定方法可同時(shí)分析檢測(cè)10種有機(jī)酸，且10種有機(jī)酸都能在10 min以內(nèi)完成檢測(cè)，達(dá)到基線分離。該方法可對(duì)黑糯米酒中有機(jī)酸進(jìn)行快速檢測(cè)分析，從而提高分析檢測(cè)效率，降低實(shí)驗(yàn)成本。

3 結(jié)論

研究建立了應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定黑糯米酒中草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、焦谷氨酸和琥珀酸含量的方法。研究表明：檢測(cè)器為二極管陣列，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，色譜柱：ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為35 ℃，流動(dòng)相為0.03 mol/L的磷酸二氫鈉溶液，pH值為2.90，在0～4.00 min，流速為1.0 mL/min；4.00～10.00 min流速為0.30 mL/min；10.00 min后流速為1.0 mL/min。黑糯米酒中的10種有機(jī)酸均在10 min內(nèi)得到有效分離，可以實(shí)現(xiàn)黑糯米酒中有機(jī)酸含量的快速檢測(cè)分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)在0.999 1～1.000，重復(fù)性試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.15%～0.87%，精密性實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.024%～0.543%，檢出限為0.014 9～0.219 0 mg/L，樣品加標(biāo)回收率在94.39%～104.73%。應(yīng)用該方法分析黑糯米酒中有機(jī)酸，可知不同酒樣中有機(jī)酸種類和含量有所差異，可明確不同酒樣中的主要有機(jī)酸。