離子色譜法同時(shí)測(cè)定啤酒中23種糖、糖醇及醇

宋衛(wèi)得，許美玲，王志宏，張傳杰*，尹相英，孫明芹

（1.日照海關(guān)，山東 日照 276800；2.龍口海關(guān)，山東 龍口 265700）

啤酒是人們?nèi)粘Ｉ钪械闹匾嬈罚且云【苹ê望溠繛樵?，?jīng)糊化、糖化、液態(tài)發(fā)酵后釀制而成的酒精飲料[1-4]。啤酒釀制過程中會(huì)產(chǎn)生多種糖類、糖醇、醇類，它們是啤酒中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)，直接影響啤酒的口感、風(fēng)味和品質(zhì)。糖類化合物是一類多羥基醛或酮，是人體生命活動(dòng)的能源物質(zhì)，是許多食品和飲料的重要成分[5-7]。糖醇是糖類的醛基或者酮基被還原后的物質(zhì)，通常是由對(duì)應(yīng)的糖經(jīng)過催化氫化而生成的甜味劑，具有預(yù)防糖尿病、熱量低、口感好等優(yōu)點(diǎn)[8-10]。醇類是某些發(fā)酵食品中的重要組分，某些醇類有益于人體健康，但是某些醇類如丁二醇，具有一定的毒性[11-12]。因此，啤酒中糖類、糖醇和醇類組分含量的測(cè)定具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，糖類、糖醇、醇類的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[13]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[14]、氣相色譜法[15-16]、酶電極法[17]、離子遷移譜法[18]、離子色譜法[19]。液相色譜法通用方便，但靈敏度低，對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的樣品測(cè)定困難；氣相色譜法靈敏度高，但是需要衍生，定量重復(fù)性差，不適宜做準(zhǔn)確定量分析；酶電極法一般僅對(duì)一種糖類進(jìn)行測(cè)定，具有較好的特異性，但是不能進(jìn)行多組分同時(shí)測(cè)定；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法和離子遷移譜法成本較高，廣泛普及應(yīng)用的難度較大。離子色譜法，是一種簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、可同時(shí)分析多類別多組分的技術(shù)方法，在食品檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。OWEN B等[20]采用脈沖安培檢測(cè)-離子色譜法測(cè)定了甘露醇、山梨醇、葡萄糖三種物質(zhì)；張水鋒等[21]采用脈沖安培-離子色譜方法分析了嬰幼兒乳粉中麥芽糖醇、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖6種組分，但是研究組分?jǐn)?shù)量較少。

本研究采用積分脈沖安培檢測(cè)（integrated pulse amperometric detection，IPAD）-離子色譜（ion chromatography，IC）法，通過深入研究色譜分離的影響因素，優(yōu)化色譜分析條件，建立了啤酒中23種糖類、糖醇、醇類同時(shí)測(cè)定的方法，該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確、選擇性好，解決了當(dāng)前啤酒中多類別多組分測(cè)定時(shí)人力物力成本高、檢測(cè)效率低的技術(shù)難題，且無有毒有害試劑使用，具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和環(huán)保效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2,3-丁二醇、乙醇、甲醇、丙三醇、赤蘚糖醇、巖藻糖、麥芽糖醇（純度均＞98%）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；木糖醇、阿拉伯糖醇、山梨醇、海藻糖、核糖醇、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、葡萄糖、果糖、乳糖、核糖、蔗糖、棉子糖、麥芽糖（純度均＞98%）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；2-脫氧-D-葡萄糖（純度＞98%）：加拿大Toronto Research Chemicals公司；氫氧化鈉（色譜純）Fisher Chemical公司；鹽酸（色譜純）：美國(guó)Merck公司；超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）、IC-RP10柱（1 cc）和IC-H10柱（1 cc）：美國(guó)Agela Technologies公司；所測(cè)樣品為隨機(jī)抽取的市售啤酒。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS5000離子色譜儀（配備電化學(xué)檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器）：美國(guó)Thermo Scientific公司；Milli-Q超純水儀：美國(guó)Millipore公司；DL-360E智能超聲波清洗器：上海之信儀器有限公司；ML802/02電子天平：瑞士梅特勒公司。

1.3 方法

1.3.1 離子色譜條件

Dionex CarboPacTMMA1色譜分離柱（4 mm×250 mm），Dionex CarboPacTMMA1保護(hù)柱（4 mm×50 mm）；積分脈沖安培檢測(cè)模式；工作電極：Gold（Au）；參比電極：AgCl電極；電位波形：Gold，Carbo，Quad；流動(dòng)相：NaOH淋洗液；流速：0.45 mL/min；柱溫：29 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。NaOH溶液淋洗液條件，0～75 min：480 mmol/L；75～80 min：480 mmol/L增至600 mmol/L；80～105min：600 mmol/L；105～110 min：600 mmol/L降至480 mmol/L；110～120 min：480 mmol/L。

1.3.2 前處理方法

移取啤酒樣品約10 g，超聲30 min（去除二氧化碳）。準(zhǔn)確取超聲后待檢樣品0.100 g，加入去離子水約150 mL，搖勻靜置15 min，全部轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中，采用去離子水定容至刻度，搖勻、靜置15 min，取10.0 mL溶液，先過已預(yù)活化的IC-H10柱（去除重金屬離子），再過0.22 μm水相濾膜，最后過已預(yù)活化的IC-RP柱（去除有機(jī)物和其他雜質(zhì)離子），棄去前3 mL，收集清液，待上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 梯度淋洗液的選擇

先后采用了NaOH溶液、NaAc溶液、NaOH溶液和NaAc溶液的梯度淋洗溶液這三種淋洗液，進(jìn)行分析測(cè)定對(duì)比，發(fā)現(xiàn)采用單純的NaOH溶液淋洗液測(cè)定23種糖類、糖醇、醇類的分離效果最好。而后進(jìn)行了NaOH溶液的等度和梯度淋洗液濃度條件下分離實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在梯度淋洗條件下，組分分離并不理想，隨著淋洗溶液中氫氧化鈉濃度的變化，基線出現(xiàn)不同程度的漂移，直接影響了定性定量分析；等度淋洗條件下，基線平衡較好，組分分離良好。因此，選取等度NaOH淋洗液進(jìn)行組分分離實(shí)驗(yàn)（80 min后采用高濃度NaOH淋洗液沖洗色譜柱），23種組分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖見圖1。由圖1可知，23種組分檢出的主要順序依次是醇類、糖醇類、糖類，各組分分離良好。

圖1 23種組分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖Fig.1 Ion chromatogram of mixed standards solution of 23 kinds of components

2.1.2 流速的選擇

考察了0.40 mL/min、0.45 mL/min、0.50 mL/min流速條件下組分分離狀況，結(jié)果表明，流速越大，壓力越大，組分保留時(shí)間縮短，流速從0.40 mL/min增至0.50 mL/min，23種組分總保留時(shí)間由80 min降至62 min，而系統(tǒng)初始?jí)毫τ?.1MPa增至10.0MPa。在0.40mL/min流速時(shí)，因?yàn)榱魉佥^低，壓力較小，導(dǎo)致組分峰寬較大，總保留時(shí)間較長(zhǎng)。0.50 mL/min流速時(shí)，系統(tǒng)壓力較大，組分總保留時(shí)間縮短，但在75 min后使用600 mmol/L NaOH淋洗液沖洗色譜柱，系統(tǒng)壓力由10.0 MPa升至12.7 MPa，接近色譜柱最高操作壓力13.8 MPa，對(duì)色譜柱的使用壽命和系統(tǒng)的整體穩(wěn)定性不利。0.45mL/min流速時(shí)，初始?jí)毫?.0 MPa，最高壓力為11.5 MPa，壓力適中，而且分離度比較理想，23種組分在70 min內(nèi)全部出峰。由此可見，增大流速可以提高色譜柱的壓力和理論塔板數(shù)，從而縮短保留時(shí)間，但是不能改變分離度和組分的洗脫順序，從減少分析時(shí)間、提高色譜柱壽命、維持系統(tǒng)穩(wěn)定角度考慮，選擇在0.45 mL/min流速條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 NaOH淋洗液濃度的選擇

為了提高23種組分的分離度和靈敏度，進(jìn)行了初始NaOH淋洗液濃度分別為450 mmol/L、470 mmol/L、480 mmol/L、490 mmol/L、500 mmol/L條件下的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著淋洗濃度逐步增大，多數(shù)組分保留時(shí)間逐步減小，但是醇類和糖醇組分受淋洗液濃度的影響較小，如組分1～6、8、11和12。這是因?yàn)榇碱惡吞谴己辛u基，在水溶液中幾乎呈中性，而糖類是多羥基（2個(gè)或以上）的醛類或酮類化合物，易發(fā)生水解，糖類的分子結(jié)構(gòu)和物化特性決定了其在MA1離子色譜柱上的保留較糖醇和醇類更強(qiáng)，受氫氧化鈉淋洗液濃度的變化影響更大。恰好能利用23種糖類、糖醇、醇類組分在不同濃度的氫氧化鈉溶液淋洗條件下，在色譜柱上保留特性的差異，來優(yōu)化改進(jìn)組分間的整體分離度。

圖2 不同NaOH淋洗液濃度下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatogram of mixed standard solution at various NaOH eluate concentrations

淋洗濃度為450 mmol/L時(shí)，組分7和8、組分19和20的分離度不高，組分10和11幾乎重疊；淋洗濃度為470 mmol/L時(shí)，組分10和11分離度不高；淋洗濃度分別為490 mmol/L、500 mmol/L時(shí)，組分14和15分離度明顯下降，而組分18和19未完全實(shí)現(xiàn)分離；而淋洗濃度為480 mmol/L時(shí)，這23種組分的整體分離度和靈敏度最為理想。因此，從整體分離效果來看，選擇淋洗濃度480 mmol/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

2.1.4 柱溫的選擇

考察了26 ℃、28 ℃、29 ℃、30 ℃、32 ℃色譜柱溫度條件下組分分離情況，結(jié)果見圖3。

圖3 不同柱溫下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖Fig.3 Ion chromatogram of mixed standard solution at different column temperature

由圖3可知，隨著柱溫的升高，組分總保留時(shí)間縮短，其中組分7和8、組分9和10的之間分離度越來越小，而組分17和18分離度越來越大。從分析溫度點(diǎn)看，26 ℃時(shí)，組分10和11、組分17和18這兩對(duì)組分幾乎重疊；28 ℃時(shí)，組分10和組分11之間的分離度不高；30 ℃時(shí)，組分18和19之間的分離度較小，不能滿足定量分析的要求；32 ℃時(shí)，組分18和19完全重疊，組分7和8、組分9和10、組分14和15這三對(duì)組分分離度較??；29 ℃時(shí)，23種組分的分離度和靈敏度均比較理想。由此可見，溫度對(duì)23種組分同時(shí)測(cè)定具有顯著的影響，每一攝氏度的變化就會(huì)導(dǎo)致兩種或幾種組分不能有效分離。從提高方法的分離度、靈敏度、選擇性角度考慮，選取在29 ℃柱溫條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

2.2 線性范圍與檢出限

配制7個(gè)不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中甲醇質(zhì)量濃度范圍在10.0～1 000 mg/L、乙醇質(zhì)量濃度范圍在2.0～200 mg/L，其他組分濃度范圍在0.025～10.0 mg/L之間，以各待測(cè)物質(zhì)質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行檢測(cè)和校準(zhǔn)曲線擬合，并計(jì)算待測(cè)組分的檢出限（S/N=3），結(jié)果見表1。由表1可知，23種組分線性相關(guān)系數(shù)R2均＞0.999，其中有18種組分相關(guān)系數(shù)R2＞0.999 5，同時(shí)23種組分線性方程截距的絕對(duì)值均＜0.008，這充分說明在此實(shí)驗(yàn)條件下，23種組分同時(shí)測(cè)定的方法穩(wěn)定、線性良好。除了甲醇和乙醇外，其他21種組分檢出限在0.011～0.197 mg/L之間。

表1 測(cè)定組分的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 1 Linear ranges,linear equations,correlation coefficient and limits of detection of determination components

2.3 回收率與精密度試驗(yàn)

抽取1種啤酒樣品，依次向樣品中添加質(zhì)量濃度水平分別為0.20 mg/L、1.00 mg/L、2.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，來驗(yàn)證方法的回收率和精密度，根據(jù)基質(zhì)濃度、添加濃度和添加后測(cè)定濃度來計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表2。由表2可知，23種糖類、糖醇、醇類組分在三個(gè)添加濃度水平下的回收率在81.27%～106.12%之間，精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD在1.53%～10.52%范圍內(nèi)?；厥章?、精密度試驗(yàn)結(jié)果均符合食品理化檢測(cè)要求[22]，表明該檢測(cè)方法精密度和準(zhǔn)確性良好。

表2 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery rates and precisions tests

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

依次抽取5種代表性啤酒（1-黃啤酒、2-黃啤酒、3-黃啤酒、4-黑啤酒、5-黑啤酒），按照離子色譜條件和前處理步驟，進(jìn)行了實(shí)際樣品中23種糖類、糖醇、醇類組分含量的檢測(cè)分析，各樣品離子色譜圖見圖4，檢測(cè)結(jié)果見表3。

圖4 5種啤酒樣品中23種糖、糖醇及醇測(cè)定的離子色譜圖Fig.4 Ion chromatogram of 23 carbohydrates,sugar alcohols and alcohols in beer samples

表3 啤酒樣品的23種糖、糖醇及醇測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of 23 carbohydrates,sugar alcohols and alcohols in beer samples

由圖4可知，測(cè)定基線穩(wěn)定，組分分離效果好，受其他干擾較小，這說明此方法穩(wěn)定性好、適用性強(qiáng)。由表3可知，五種啤酒中檢出的糖類、糖醇、醇類組分總數(shù)量依次是13、16、14、17、15種，啤酒中檢出有益組分的種類越多、含量越大，該啤酒的品質(zhì)就越好，實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果與樣品實(shí)際品質(zhì)狀況完全相符。從檢出組分來看，檢出含量較大的組分依次是丙三醇、乙醇、乳糖、葡萄糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇等。從啤酒種類來看，黑啤酒中糖類、糖醇比黃啤酒中的種類和含量更加豐富。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)流速、淋洗液濃度、色譜柱溫度等實(shí)驗(yàn)影響因素的分析討論，探索出了適于23種糖、糖醇及醇類同時(shí)檢測(cè)的色譜分析條件，建立了積分脈沖安培-離子色譜法同時(shí)測(cè)定啤酒中23種糖、糖醇及醇類的分析方法。當(dāng)流速為0.45 mL/min，淋洗濃度為480 mmol/L，柱溫為29 ℃時(shí)，23種組分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（R2＞0.999）。除了甲醇和乙醇外，其他21種組分檢出限（LOD）在0.011～0.197 mg/L；在0.20 mg/L、1.00 mg/L、2.00 mg/L三個(gè)添加濃度水平下，23種組分的回收率為81.27%～106.12%，精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.53%～10.52%。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，完全適于啤酒釀制加工、質(zhì)量控制和安全監(jiān)管等過程中多種糖、糖醇及醇類的快速篩查分析。