無乳鏈球菌對星洲紅魚的致病性及藥物敏感性研究

林祥日，謝丹丹，林旭吟，趙梅英

(廈門海洋職業(yè)技術學院 生物技術系，福建 廈門 361100)

上世紀80年代以來,世界范圍內廣泛出現魚類鏈球菌感染。魚類鏈球菌病已成為世界水產養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病,受感染的魚類包括多種海水、半咸水和淡水養(yǎng)殖魚類[1],以羅非魚最為易感。星洲紅魚(Red Tilapia) 隸屬于鱸形目(Perciformes)、麗魚科(Cichlidae)、羅非魚屬(Tilapia)種間雜交的一個品種,由新加坡、臺灣等地的養(yǎng)殖專家經過二十余年的不斷改良而成。其體色全紅,生長速度快;耐低溫能力強;肉質鮮滑爽甜,無肌間刺,與一般羅非魚相比更受廣大民眾的喜愛[2]。鏈球菌病對羅非魚養(yǎng)殖造成了嚴重威脅,目前有關羅非魚鏈球菌病研究已有不少報道,國內、外報道主要病原有海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)[3-4]和無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)[5-7]2種。有關星洲紅魚的研究主要集中在健康養(yǎng)殖技術[2]、形態(tài)[8-10]、染色體和細胞核 DNA含量[9]、呼吸代謝[11-12]等方面,而對星洲紅魚鏈球菌病研究尚少。本研究采用無乳鏈球菌對30～50 g大小的健康的星洲紅魚進行人工感染試驗和藥敏試驗,旨在對無乳鏈球菌的致病性以及藥物敏感性進行研究,以期為預防無乳鏈球菌引起的魚類細菌性疾病提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗用魚 星洲紅魚來自廈門市集美灌口養(yǎng)殖場,體重30～50 g/尾。星洲紅魚經5 d暫養(yǎng)適應,穩(wěn)定后供人工感染用。

1.1.2 試驗材料 腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基(BHI)，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)購自北京陸橋技術有限責任公司；藥敏紙片購自杭州微生物制劑有限公司；麥氏比濁管購自廣州環(huán)凱微生物有限公司。

1.1.3 菌株 感染試驗用的無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae,SCTnS110902NA菌株)是由福建省淡水水產研究所提供的。

1.2 實驗方法

1.2.1 人工感染試驗 將無乳鏈球菌菌株接種于腦心浸液(BHI)瓊脂培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)48 h,用無菌生理鹽水配制成2.0×109、2.0×108、2.0×107、2.0×106、2.0×105CFU/mL的細菌懸液(采用平板菌落計數法計數),每個梯度設置2組, 每組6尾,每尾肌肉注射細菌懸液0.2 mL,對照組注射相同劑量的無菌生理鹽水。將試驗魚和對照魚飼養(yǎng)在水溫為28 ℃的不同水族箱(100 cm×50 cm×35 cm)中,連續(xù)充氣,每天觀察供試魚的發(fā)病癥狀與死亡情況,并及時撈出死魚,連續(xù)觀察15 d。

1.2.2 人工感染后星洲紅魚體內菌落總數測定 選用2.0×108CFU/mL菌液濃度進行人工感染試驗。設置試驗組與對照組,其中試驗組設 2組,每組20尾魚。將無乳鏈球菌菌株接種于腦心浸液(BHI)瓊脂培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)48 h,用無菌生理鹽水配制成2.0×108CFU/mL的細菌懸液,給2組試驗魚注射,每尾肌肉注射細菌懸液0.2 mL,對照組注射相同劑量的無菌生理鹽水,將試驗魚和對照魚飼養(yǎng)在水溫為25 ℃的水族箱(30 cm×25 cm×50 cm)中。試驗魚一組用于統(tǒng)計感染無乳鏈球菌后星洲紅魚的癥狀和死亡情況,另一組用于統(tǒng)計體內細菌菌落數的動態(tài)變化,分別在感染后0、24、48、96、192 h隨機取3尾。對照組在感染后0和192 h隨機取3尾。用75%酒精擦拭魚體表消毒,無菌解剖,檢測星洲紅魚肌肉、肝臟、心臟等組織細菌動態(tài)分布。菌落總數測定方法參照GB4789.2-2016食品衛(wèi)生微生物學檢驗菌落總數測定。

1.2.3 藥物敏感試驗 采用藥敏紙片瓊脂平板擴散法[5,13-14]。將無乳鏈球菌菌株接種于腦心浸液(BHI)瓊脂培養(yǎng)基,經30 ℃培養(yǎng)48 h,用無菌生理鹽水配制成濃度1.0×108CFU/mL細菌懸液(相當于0.5麥氏標準),用無菌微量移液槍移取100 μL細菌懸液于BHI平板上,用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面上輕輕地涂布均勻,室溫下靜置5～10 min,適當干燥,使菌液吸附在培養(yǎng)基上,然后貼上藥敏紙片。每皿4片,每種藥物2片,倒置放入30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后,測量藥敏紙片周圍抑菌環(huán)直徑的大小。根據杭州微生物制劑有限公司的藥敏紙片法的抑菌范圍解釋標準判定菌株對藥物的敏感度。

1.2.4 數據處理 所有的數據均用平均數±標準差(Mean±SD)形式表示。采用 SPSS軟件進行方差分析和多重比較及回歸分析。

2 結果與分析

2.1 人工感染試驗

試驗結果表明:所選用的無乳鏈球菌菌株對星洲紅魚具有較強的致病力。通過人工感染,注射5個不同濃度菌液的試驗魚相繼出現不同程度的死亡(表1)。注射較高濃度菌液的魚死亡數量較多,注射較低濃度菌液的魚死亡數量較少,其中菌液濃度達2.0×109CFU/mL時,死亡率最高(91.7%)。魚死前多數出現不安、狂游的狀況。部分魚體出現腹部出血、蛀鰭,眼球渾濁、突出等鏈球菌病典型癥狀,與自然發(fā)病魚的癥狀相似。對照組在觀察的時間里,表現正常,無死亡現象。

表1 人工感染試驗結果

2.2 人工感染后星洲紅魚體內細菌菌落數統(tǒng)計

試驗結果表明:對照組星洲紅魚在試驗時間內(192 h)表現正常,無死亡現象。試驗組星洲紅魚肌肉注射無乳鏈球菌懸液后,在試驗時間內均未死亡,但部分魚出現明顯的發(fā)病癥狀,主要表現:離群獨游,體表局部出血,鰭基部充血、發(fā)紅,尾柄潰爛;眼球突出或渾濁發(fā)白,眼眶充血;肝臟和腎臟腫大、出血等癥狀。

由表2可知,星洲紅魚肌肉、肝臟的菌落數均隨感染時間的延長有上升的趨勢,高峰值均為感染后192 h。心臟的菌落數隨感染時間變化不呈一定的規(guī)律性，但高峰值也是感染后192 h。由表3可知,對照組星洲紅魚在試驗時間內(192 h)各組織的細菌菌落數少且變化不明顯,t檢驗結果表明感染時間對對照組星洲紅魚肝臟、肌肉、心臟的菌落數無顯著影響(P>0.05)。方差分析表明,不同感染時間試驗組星洲紅魚肝臟、肌肉、心臟的菌落數存在極顯著差異(P<0.01)(表4)。

表2 不同感染時間試驗組星洲紅魚各組織的菌落數

表3 不同感染時間對照組星洲紅魚各組織的菌落數

表4 不同感染時間星洲紅魚肝臟、肌肉和心臟菌落數方差分析表

回歸分析表明,星洲紅魚肌肉、肝臟的菌落數與感染時間之間均存在顯著的曲線相關關系(P<0.05),可用二次曲線方程y=b0+b1x+b2x2表示,詳見表5和圖1～2。星洲紅魚心臟的菌落數與感染時間之間相關關系不顯著(P>0.05)。

表5 星洲紅魚各組織菌落數與感染時間的回歸方程的系數

圖1 星洲紅魚肝臟菌落數與感染時間的關系

圖2 星洲紅魚肌肉菌落數與感染時間的關系

2.3 藥物敏感試驗

試驗結果表明,所選用的無乳鏈球菌菌株對青霉素G、萬古霉素、紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、氟哌酸、左氧氟沙星、利福平、強力霉素、妥布霉素、阿米卡星、乙基西梭霉素等14種藥物敏感(S);該菌株對多粘菌素B、新生霉素、阿莫西林較敏感(I);該菌株對氨芐西林、頭孢噻肟、丙氟哌酸、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、麥迪霉素、氟苯尼考、林可霉素、克林霉素、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢呋辛、頭孢他啶、呋喃妥因、復方新諾明、磺胺甲基異惡唑等19種藥物不敏感(R)(表6)。

表6 藥物敏感性試驗結果

3 結論與討論

無乳鏈球菌病全年都可發(fā)生,水溫25～37 ℃時較為流行[6,15],32 ℃以上時尤為多發(fā)[3,16],水溫降至20 ℃以下時則較少?？砂l(fā)生于各種規(guī)格的羅非魚,但對較大的魚(大于100 g)更易感染[7]。發(fā)病進程和臨床癥狀受菌液感染濃度和水溫影響明顯。無乳鏈球菌感染濃度較高時,魚出現急性死亡,不表現明顯癥狀;采用低濃度無乳鏈球菌感染時,5 d后魚表現出眼球渾濁等亞急性感染癥狀[7]。尼羅羅非魚感染無乳鏈球菌后,水溫越高,其感染死亡率越高,高溫組(33 ℃)患病羅非魚出現打轉、側翻、離群狂游、體色發(fā)黑等臨床癥狀。低溫組(25 ℃)發(fā)病羅非魚僅出現體色發(fā)黑、游動緩慢的癥狀[17]。本研究采用無乳鏈球菌對30～50 g健康的星洲紅魚進行人工感染試驗。實驗結果表明,在28 ℃水溫條件下注射高濃度菌液(2.0×109CFU/mL)的星洲紅魚死亡數量較多,死前多數出現不安、狂游現象;注射較低濃度菌液的星洲紅魚則死亡數量較少,表現出亞急性感染癥狀。在25 ℃水溫條件下注射2.0×108CFU/mL菌液的星洲紅魚在感染192 h內沒有出現死亡,但出現眼球突出或渾濁發(fā)白等亞急性感染癥狀。這與一些學者的研究結果是相似[7,17],第二次人工感染試驗星洲紅魚沒有出現死亡,可能與我們當時的水溫較低和試驗魚規(guī)格較小有關。

郭富強等對尼羅羅非魚研究表明低溫條件下(25 ℃)腦、肝臟、脾臟和腎臟等組織中無乳鏈球菌的濃度在感染后24 h或48 h即達到峰值,且組織中無乳鏈球菌的最大載菌量均較低[17]。朱佳杰等研究結果發(fā)現腹腔注射法可使吉富羅非魚快速感染無乳鏈球菌而呈現發(fā)病癥狀,并在31～ 32 ℃水溫感染5 h后相繼出現死亡[18]。本研究采用肌肉注射無乳鏈球菌方式進行人工感染,僅對感染后星洲紅魚的肝臟、心臟和肌肉組織中的細菌菌落數進行統(tǒng)計,結果顯示:25 ℃水溫條件下不同感染時間試驗組星洲紅魚肝臟、肌肉、心臟的菌落數存在極顯著差異(P<0.01)。感染后星洲紅魚肌肉、肝臟的菌落數均隨感染時間的延長有上升的趨勢,心臟的菌落數隨感染時間變化不呈一定的規(guī)律性,三者高峰值均為感染后192 h,以肝臟的菌落數最多。星洲紅魚肌肉、肝臟的菌落數與感染時間之間均存在顯著的曲線相關關系(P<0.05),星洲紅魚心臟的菌落數與感染時間之間相關關系不顯著(P>0.05)。本研究結果與一些學者報道不一致[17-18],這可能是感染試驗用的菌株的毒力、試驗魚品種、機體免疫力、水溫、注射部位不同所導致[19]。

無乳鏈球菌易產生耐藥性,不同養(yǎng)殖環(huán)境、反復或連續(xù)用藥等對無乳鏈球菌的耐藥性有直接影響。不同無乳鏈球菌菌株對不同藥物的敏感度有較大差異。黃艷華等研究表明無乳鏈球菌株對先鋒霉素VI、氧氟沙星、先鋒必、多西環(huán)素和鹽酸沙拉沙星敏感[5]。柯劍等研究表明無乳鏈球菌株對環(huán)丙沙星、克拉霉素等敏感,對氨芐西林、克林霉素等耐藥,且各菌株對萬古霉素、慶大霉素、青霉素 G、妥布霉素、頭孢唑啉、阿米卡星的敏感性有所不同[7]。本研究藥敏試驗結果表明:試驗所用的無乳鏈球菌株菌株對青霉素G、萬古霉素、紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、氟哌酸、左氧氟沙星、利福平、強力霉素、妥布霉素、阿米卡星、乙基西梭霉素等14種藥物敏感。該菌株藥敏試驗結果與上述學者研究結果不盡相同,這可能是與菌株來源地間的養(yǎng)殖環(huán)境和用藥習慣不同有關。

試驗所用的無乳鏈球菌菌株對星洲紅魚具有較強的致病力,可選用青霉素G、阿奇霉素、克拉霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星、利福平、強力霉素、妥布霉素、阿米卡星和乙基西梭霉素等藥物防治星洲紅魚無乳鏈球菌病。