不同銀杏無(wú)性系葉片萜內(nèi)酯含量的差異性研究

何佳林，李瀟雨，李秀紅，季志平

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

銀杏Ginkgo biloba是古老的孑遺植物，素有“活化石”之稱(chēng)，現(xiàn)已在全國(guó)廣泛栽培，具有極高的研究和開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。我國(guó)擁有世界銀杏資源的70%以上[1-6]，開(kāi)發(fā)利用潛力巨大。銀杏的葉、果、樹(shù)皮均可入藥，尤其是葉，藥用價(jià)值很高。銀杏葉主要含萜內(nèi)酯（terpene lactones）類(lèi)化合物[7-9]，對(duì)心腦血管疾病具有較好的療效。

銀杏萜內(nèi)酯被認(rèn)為是銀杏葉中關(guān)鍵的藥用活性成分，銀杏葉片萜內(nèi)酯含量是衡量葉片質(zhì)量?jī)?yōu)劣的一個(gè)極其重要的指標(biāo)，也是選育優(yōu)良品種的指標(biāo)之一[1,4]。本文對(duì)陜西寶雞銀杏資源圃引進(jìn)和篩選的20個(gè)銀杏優(yōu)良無(wú)性系葉片萜內(nèi)酯的含量進(jìn)行了差異性分析研究，旨在為藥用銀杏品種的選育和開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為陜西寶雞銀杏資源圃引進(jìn)和篩選的20個(gè)銀杏優(yōu)良無(wú)性系，見(jiàn)表1。

表1 20個(gè)銀杏無(wú)性系來(lái)源Table 1 Origin of 20 G.biloba clones

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 2016年9月中旬，在資源圃對(duì)供試銀杏進(jìn)行了生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定。

（1）用DQW-2望遠(yuǎn)測(cè)樹(shù)儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樹(shù)樹(shù)高，用圍尺測(cè)量地徑，并統(tǒng)計(jì)樹(shù)干主要側(cè)枝數(shù)及單株產(chǎn)葉數(shù)；

（2）每個(gè)無(wú)性系隨機(jī)選取3株樣株，在每株樣株上、中、下部位的不同方位隨機(jī)摘取30張完全功能葉片帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)定（以下每項(xiàng)均測(cè)定全部葉片，取平均值）：用游標(biāo)卡尺測(cè)量單葉長(zhǎng)、葉寬、葉柄長(zhǎng)；用EPSON4990掃描儀（上海迎盛辦公設(shè)備有限公司）測(cè)量單葉葉面積；用Olympus顯微鏡（上海卓康生物科技有限公司）測(cè)量葉厚；用BS210S電子自動(dòng)天平測(cè)定單葉鮮質(zhì)量及單葉干質(zhì)量，并計(jì)算葉片含水率：

（3）株葉鮮質(zhì)量采用標(biāo)準(zhǔn)枝調(diào)查方法：清點(diǎn)出標(biāo)準(zhǔn)枝上的總?cè)~片數(shù)，隨機(jī)摘取上、中、下部位不同方位的葉片50片，帶回實(shí)驗(yàn)室稱(chēng)量，計(jì)算葉片平均質(zhì)量，獲得株葉鮮質(zhì)量。每株樣株只選擇一枝標(biāo)準(zhǔn)枝，不重復(fù)。

1.2.2 銀杏萜內(nèi)酯含量測(cè)定 采用高效液相色譜法[10-12]。試驗(yàn)所用儀器包括高效液相色譜儀（Waters公司）、510泵、Lambda-Max 481蒸散光檢測(cè)器、740數(shù)據(jù)處理機(jī)、色譜柱為Water Nova-Pak C18柱（4.6 mm×20 cm）。檢測(cè)的萜內(nèi)酯主要包括：白果內(nèi)酯（110865-200404）、銀杏內(nèi)酯A（110862-200305）、銀杏內(nèi)酯B（110863-200507）和銀杏內(nèi)酯C（110864-200304）。對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈為色譜純，水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。

首先將鮮樣葉在80～90℃鼓風(fēng)烘箱中烘干15～30 min，然后降溫至60～70℃，烘干至恒重，用研缽或帶刀片的磨樣機(jī)粉碎，過(guò)60目篩裝瓶備用。每個(gè)測(cè)試材料取干燥粉碎葉片500 mg，用5 mL 10%甲醇水溶液提取15 min，過(guò)濾，將濾液按每秒1滴的速度過(guò)聚酰胺柱，然后蒸發(fā)濾液，殘?jiān)眉状既芙?，加入少量苯甲醇和水。色譜流動(dòng)相為水-甲醇-二氫呋喃（7:2:1），流速為1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)219 nm，C18柱。

式中，G為峰面積；I.S為內(nèi)標(biāo)（苯甲醇）峰面積；M為銀杏葉質(zhì)量；R為分離度，是相鄰色譜峰保留時(shí)間之差與兩色譜峰峰寬均值之比。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理及分析方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、相關(guān)性分析、逐步回歸分析后找出影響銀杏萜內(nèi)酯含量的相關(guān)規(guī)律并建立回歸模型。從各生長(zhǎng)指標(biāo)間單因素相關(guān)性分析結(jié)果中剔除5個(gè)相關(guān)性較弱的因子（側(cè)株數(shù)、葉基角、株葉數(shù)、葉柄長(zhǎng)、地徑），對(duì)20個(gè)品種的10個(gè)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析（Principal Components）。分別采用不旋轉(zhuǎn)法（None）、方差最大法（Varimax）、四次方最大法（Quartimax）、等量最大法（Equamax）和斜交旋轉(zhuǎn)法（Promax），計(jì)算出相關(guān)系數(shù)矩陣及其特征值、各主成分的貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率，以累積貢獻(xiàn)率大于85%的原則選擇主成分。在主成分分析的基礎(chǔ)上，通過(guò)聚類(lèi)分析法選擇具有優(yōu)良品性的葉用銀杏無(wú)性系。

采用主成分分析方法，將累計(jì)貢獻(xiàn)率>85%的各個(gè)主成份的權(quán)重系數(shù)分別乘以各指標(biāo)原始數(shù)據(jù)后求其與萜內(nèi)酯含量之間相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏葉總萜內(nèi)酯含量與生長(zhǎng)指標(biāo)相關(guān)性分析

對(duì)20個(gè)銀杏無(wú)性系的生長(zhǎng)指標(biāo)和葉總萜內(nèi)酯含量進(jìn)行了測(cè)定，將主要性狀測(cè)定結(jié)果的平均值列于表2，并統(tǒng)計(jì)分析各性狀指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表2 20個(gè)銀杏無(wú)性系的平均生長(zhǎng)指標(biāo)和葉總萜內(nèi)酯含量Table 2 Average growth traits and total terpene lactones of 20 tested clones

從表2可以看出，僅按葉總萜內(nèi)酯的含量比較，以陜引6號(hào)、馬鈴3號(hào)的葉總萜內(nèi)酯含量最高。進(jìn)一步分差分析（表3）表明，銀杏葉總萜內(nèi)酯含量與葉寬、葉柄長(zhǎng)和葉厚呈弱線性正相關(guān)關(guān)系；與樹(shù)高、葉長(zhǎng)、葉面積、葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量呈強(qiáng)線性正相關(guān)關(guān)系，其中與樹(shù)高、葉長(zhǎng)、葉干質(zhì)量之間達(dá)到極顯著相關(guān)（P＜0.01），其相關(guān)系數(shù)分別為0.695，0.565，0.640；與地徑呈弱線性負(fù)相關(guān)關(guān)系；與葉含水率呈強(qiáng)線性負(fù)相關(guān)關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)為-0.480。根據(jù)以上結(jié)果，說(shuō)明樹(shù)高、葉長(zhǎng)、葉面積、葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量越大且葉含水率越低的銀杏無(wú)性系，其葉總萜內(nèi)酯含量越大。

表3 葉總萜內(nèi)酯含量與銀杏各生長(zhǎng)指標(biāo)間相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis on total terpene lactone with growth traits

由表3可以看出，銀杏葉總萜內(nèi)酯含量分別與樹(shù)體指標(biāo)中的樹(shù)高，葉形指標(biāo)中的葉長(zhǎng)、葉面積，葉質(zhì)量指標(biāo)中的葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量、葉含水率存在顯著或極顯著相關(guān)關(guān)系，但與葉形指標(biāo)中的葉寬、葉柄長(zhǎng)和葉厚相關(guān)性較弱。根據(jù)以上結(jié)果，說(shuō)明樹(shù)體指標(biāo)和葉形指標(biāo)中各指標(biāo)對(duì)銀杏葉總萜內(nèi)酯含量的影響并不一致，所以，只能確定葉片質(zhì)量指標(biāo)對(duì)銀杏總萜內(nèi)酯含量有顯著影響。

2.2 主成分分析

葉萜內(nèi)酯含量高的無(wú)性系，其株葉萜內(nèi)酯總量不一定高，因?yàn)橛绊戙y杏株葉萜內(nèi)酯總量的指標(biāo)很多，它們間相互關(guān)聯(lián)而且所反映的側(cè)重點(diǎn)各不相同，因此，需要從諸多性狀指標(biāo)中篩選幾個(gè)新的綜合變量，而又不丟失原來(lái)多個(gè)性狀指標(biāo)所提供的主要信息，從而簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，降低分析難度。主成分分析無(wú)疑提供了極佳的手段。

2.2.1 特征值和特征向量 主成分的特征值和貢獻(xiàn)率是選擇主成分的依據(jù)。表4把原有10個(gè)原性狀指標(biāo)轉(zhuǎn)化為10個(gè)主成分的詳細(xì)信息。從表4中可以看出，第1個(gè)主成分的特征值為5.6，方差貢獻(xiàn)率為55.6%，代表了全部性狀55.6%的信息，是最主要的主成分。

表4 主成分的特征值、貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)Table 4 Eigenvalue and contribution rate and cumulative contribution rate of principal components

第2個(gè)主成分的特征值為2.4，方差貢獻(xiàn)率為23.6%。第3個(gè)主成分的特征值為1.1，方差貢獻(xiàn)率為10.6%。其他主成分的貢獻(xiàn)率依次明顯減少。前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到89.9%（>85%），表明前3個(gè)主成分已經(jīng)代表了全部因子89.9%的綜合信息，其余成分所起的作用很小。從圖1可看出，3個(gè)主成分在空間分布范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的差異。因此，選取前3個(gè)主成分作為影響株葉內(nèi)酯總量的重要主成分，分別用F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3表示。

2.2.2 各主成分與株葉萜內(nèi)酯總量的相關(guān)性分析

圖1 3個(gè)主成分空間分布圖Figure 1 Spatial distribution of 3 principal components

根據(jù)主成分各載荷因子所占權(quán)重命名各主成分（表5）：第一主成分為葉綜合因子；第二主成分為葉產(chǎn)量因子；第三主成分為葉質(zhì)量因子。上述3個(gè)主成份累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到89.886%，可以很好地反映原指標(biāo)所包含的絕大部分信息，這說(shuō)明該3個(gè)主成分是表征萜內(nèi)酯總量的關(guān)鍵因子，具有較強(qiáng)的綜合代表性、分析的可靠性和穩(wěn)定性。

將3個(gè)主成分的各權(quán)重系數(shù)分別乘以各指標(biāo)原始數(shù)據(jù)后求其與株葉萜內(nèi)酯總量間的相關(guān)性。從計(jì)算結(jié)果可以看出，3個(gè)主成分均與株葉萜內(nèi)酯總量相關(guān)性較高（表6）。說(shuō)明第一主成分中占較大載荷因子的是葉鮮質(zhì)量、葉面積、葉長(zhǎng)和葉干質(zhì)量，第二主成分中占較大載荷因子的是株葉數(shù)、株葉鮮質(zhì)量、株葉干質(zhì)量和樹(shù)高，第三主成分中占較大載荷因子的是葉含水率和葉厚。進(jìn)一步證實(shí)上述10個(gè)生長(zhǎng)指標(biāo)就是影響銀杏萜內(nèi)酯的主要指標(biāo)。

2.3 聚類(lèi)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件DPS軟件包中提供的聚類(lèi)分析應(yīng)用程序，采用歐氏連接距離法對(duì)這20個(gè)供試材料進(jìn)行Q型聚類(lèi)分析。為了消除指標(biāo)間數(shù)量級(jí)差異對(duì)聚類(lèi)分析結(jié)果的影響，對(duì)原始數(shù)據(jù)采用極大值標(biāo)準(zhǔn)化法處理再進(jìn)行聚類(lèi)分析，計(jì)算歐氏距離使用的統(tǒng)計(jì)量取用主成分分析中的轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)。聚類(lèi)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在歐氏連接距離λ=431.25時(shí)，根據(jù)生長(zhǎng)指標(biāo)和株葉萜內(nèi)酯總量把20個(gè)銀杏無(wú)性系分為性狀差異明顯的5個(gè)大類(lèi)，第Ⅰ類(lèi)：C94-16，C95-09和C94-56；第Ⅱ類(lèi)：C95-07，C95-11和陜引19；第Ⅲ類(lèi)：C94-68，C95-08；第Ⅳ類(lèi)：C95-17，陜引17號(hào)，馬嶺3號(hào)，陜引10號(hào)，陜引16號(hào)，陜引21號(hào)，陜引23號(hào)和陜引26號(hào)；第Ⅴ類(lèi)：陜引6號(hào)，陜引9號(hào)，陜引11號(hào)和陜引12號(hào)。

表5 因子載荷矩陣Table 5 Factor loading matrix

表6 主成分與株葉萜內(nèi)酯總量相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis on principal components and total terpene lactones

對(duì)聚類(lèi)分析所得的5類(lèi)銀杏無(wú)性系主要生長(zhǎng)指標(biāo)及株葉萜內(nèi)酯總量進(jìn)行比較分析，結(jié)果見(jiàn)表7。從表7中可以看出，第Ⅰ、第Ⅱ類(lèi)無(wú)性系的葉含水率、株葉數(shù)、株葉鮮質(zhì)量和株葉干質(zhì)量較第Ⅲ、第Ⅳ、第Ⅴ類(lèi)有明顯的優(yōu)勢(shì)，而這些指標(biāo)恰恰是影響株葉萜內(nèi)酯總量最主要的因素。單從葉萜內(nèi)酯的含量看，陜引6號(hào)、馬鈴3號(hào)的葉萜內(nèi)酯含量最高，但產(chǎn)葉量都極低，株葉萜內(nèi)酯總量小，所以未能歸入第Ⅰ類(lèi)和第Ⅱ類(lèi)。雖然第Ⅲ類(lèi)的葉長(zhǎng)、葉面積、葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量均大于第Ⅱ類(lèi)，但影響株葉萜內(nèi)酯總量的指標(biāo)株葉數(shù)、株葉鮮質(zhì)量、株葉干質(zhì)量卻低于第Ⅱ類(lèi)，因此，若以藥用成分銀杏萜內(nèi)酯總產(chǎn)量為目的選擇栽培無(wú)性系，則適宜在第Ⅰ、第Ⅱ類(lèi)中選擇優(yōu)勢(shì)材料。綜合以上分析結(jié)果得出，C94-16，C95-09和C94-56可以作為藥用銀杏的優(yōu)選材料。

圖2 銀杏無(wú)性系萜內(nèi)酯總量聚類(lèi)分析Figure 2 Cluster analysis on total terpene lactones in 20 clones

表7 聚類(lèi)分析結(jié)果主要性狀對(duì)比Table 7 Cluster analysis on main traits

3 結(jié)論與討論

（1）銀杏葉萜內(nèi)酯含量與其生長(zhǎng)指標(biāo)間存在一定的相關(guān)性，銀杏葉萜內(nèi)酯含量與葉寬、葉柄長(zhǎng)和葉厚呈弱線性正相關(guān)關(guān)系；與樹(shù)高、葉長(zhǎng)、葉面積、葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量呈強(qiáng)線性正相關(guān)關(guān)系，其中與樹(shù)高、葉長(zhǎng)、葉干質(zhì)量達(dá)到極顯著相關(guān)關(guān)系，而與葉含水率呈強(qiáng)線性負(fù)相關(guān)關(guān)系。但是，銀杏葉萜內(nèi)酯的含量不是受單一因素的調(diào)控，而是受到包括光照、溫度、土壤濕度等綜合條件影響，光照等環(huán)境因素又與植物自身的生理調(diào)節(jié)存在著密切的聯(lián)系[13]。也就是說(shuō)，銀杏葉萜內(nèi)酯受多個(gè)環(huán)境因素的綜合調(diào)控，外部環(huán)境不僅影響銀杏的生長(zhǎng)發(fā)育，而且通過(guò)對(duì)銀杏的生理調(diào)節(jié)作用來(lái)影響銀杏葉萜內(nèi)酯含量。

（2）主成分分析表明，占較大載荷因子的葉質(zhì)量、葉面積、葉長(zhǎng)、樹(shù)高和葉含水率是影響銀杏萜內(nèi)酯含量的主要因子。

（3）聚類(lèi)分析結(jié)果表明，C94-16，C95-09和C94-56三個(gè)銀杏無(wú)性系的生長(zhǎng)性狀、葉總萜內(nèi)酯含量及株葉萜內(nèi)酯總量方面比其他無(wú)性系具有綜合優(yōu)勢(shì)，因此，可以從這三個(gè)優(yōu)系中選育最適合以藥用成分銀杏萜內(nèi)酯為目標(biāo)的銀杏栽培優(yōu)良無(wú)性系。

（4）本研究只針對(duì)20個(gè)銀杏無(wú)性系葉萜內(nèi)酯含量的差異性進(jìn)行了研究，而對(duì)引起這些差異的內(nèi)在機(jī)理尚不明確，有待于今后進(jìn)一步深化研究。