4,8-DHT林地除草活性研究

胡琪瑤 ，范曉聰，楊 麗，阮 曉，章建紅，王 強(qiáng)，鄭炳松

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；2.浙大寧波理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 寧波 315100）

近百年來(lái)，人類使用化學(xué)除草劑有效控制了多種雜草危害，但化學(xué)合成除草劑的大量使用也引發(fā)了環(huán)境污染、雜草耐藥性增強(qiáng)、對(duì)非目標(biāo)生物毒害等一系列嚴(yán)重環(huán)境問(wèn)題。天然生物除草劑具有生產(chǎn)原料來(lái)源廣泛，對(duì)非靶標(biāo)生物安全、毒副作用小、環(huán)境兼容性好等特點(diǎn)，已成為全球農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新趨勢(shì)。4-8-二羥基-1-四氫萘酮（4,8-DHT）作為一種天然產(chǎn)物最初由Findlay等[1]從小柱孢屬Scytalidium物種中分離出來(lái)，隨后又從多種真菌以及植物中分離純化。Eduardo等[2]通過(guò)理論計(jì)算發(fā)現(xiàn)其具有兩種不同的構(gòu)型，分別為R-(-)-(4R)-4,8-DHT（Regiolone）和S-(+)-(4S)-4,8-DHT（Isosclerone）。生物學(xué)活性研究表明，4,8-DHT對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞具有一定的體外增殖抑制作用[3]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)山核桃外果皮水提取物對(duì)雙子葉植物萵苣Lactuca sativa，蘿卜Raphanus sativus，黃瓜Cucumis sativus和單子葉植物洋蔥Allium cepa，稻Oryza sativa，普通小麥Triticum aestivum的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)存在抑制作用。其外果皮水提取物經(jīng)X-5大孔樹脂分離，乙醇水溶液梯度洗脫，利用萵苣種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)作為除草活性篩選參數(shù)，發(fā)現(xiàn)11個(gè)洗脫組分中以6:4，5:5，4:6，3:7的洗脫相活性最強(qiáng)，硅膠柱層析和葡聚糖凝膠色譜組合分離純化目標(biāo)組分，利用UPLC，NMR，GC-MS等技術(shù)手段組合解析活性組分結(jié)構(gòu)為4,8-DHT[4]。目標(biāo)產(chǎn)物經(jīng)Chiral OD-H手性色譜柱拆分，獲得消旋體S-(+)-Isosclerone和R-(-)-Regiolone，S-(+)-Isosclerone對(duì)測(cè)試植物反枝莧Amaranthus retroflexus，牛筋草Eleusine indica，百喜草Paspalum notatum，香附子Cyperus rotundus和西伯利亞剪股穎Agrostis stolonifera抑制活性高于R-(-)-Regiolone[5-7]。Zhang等建立了以1,5-二羥基萘為原料，五步法合成4,8-DHT外消旋體及結(jié)構(gòu)改造物5-羥基-4-氧代-1,2,3,4-四氫萘-1-苯甲酸乙酯、8-羥基-4-(3-羥基丙氧基)-1-四氫萘酮、8-羥基-4-(2,3-二羥基丙氧基)-1-四氫萘酮、5-羥基-8-氧代-5,6,7,8-四氫萘-1-苯甲酸乙酯、4-羥基-8-(3-羥基丙氧基)-1-四氫萘酮和4-羥基-8-(2,3-二羥基丙氧基)-1-四氫萘酮的化學(xué)合成方法[7-8]，并分別在實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證了這些新結(jié)構(gòu)化合物的除草活性。

除草劑室內(nèi)生物測(cè)定方法普遍采用培養(yǎng)皿法（種子萌發(fā)法），目標(biāo)除草劑處理雜草種子，通過(guò)發(fā)芽率、鮮質(zhì)量、根或莖的抑制情況計(jì)算抑制中濃度，判斷目標(biāo)除草劑的生物活性。除草劑田間生物測(cè)定方法則根據(jù)《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（一）》[9]在特定田地間對(duì)靶標(biāo)生物施用目標(biāo)除草劑，在不同時(shí)期分別測(cè)量靶標(biāo)生物的株防效、鮮質(zhì)量防效等參數(shù)來(lái)判斷田間試驗(yàn)的藥效。本試驗(yàn)依據(jù)《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（一）中除草劑防除林地雜草》（GB／T17980.48-2000）設(shè)置試驗(yàn)處理，以覆蓋率、株防效為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究4,8-DHT對(duì)東京櫻花Cerasus yedoensis及紫薇Lagerstroemia indica林地中雜草的防除效果，以期為潛在除草活性物質(zhì)4,8-DHT的進(jìn)一步開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)并可提高山核桃外果皮的附加值。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

供試藥劑4,8-DHT（純度＞97%）為實(shí)驗(yàn)室制備，配置濃度分別為9，18，36 mmol·L-1；對(duì)照藥劑41%草甘膦異丙胺鹽由河北廊坊中國(guó)農(nóng)科院研究基地提供。

2.2 試驗(yàn)地概況

4,8-DHT田間試驗(yàn)在寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院林科所實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。該基地位于浙江省寧波市橫溪鎮(zhèn)大岙村，地理坐標(biāo)為121°35′ E，29°40′ N，試驗(yàn)地總面積為10.67 hm2。年均氣溫為16.2℃，年均降水量為1 538.8 mm，年均雨日為174 d，年均日照為2 070 h，無(wú)霜期為238 d。土壤表層（0～ 15 cm）的基本理化性質(zhì)為：pH 6.0，電導(dǎo)率88.5 μs·cm-1，有機(jī)質(zhì)43.8 g·kg-1，全氮1.3 g·kg-1，全磷0.7 g·kg-1，全鉀22.8 g·kg-1，堿解氮131.0 mg·kg-1，速效磷62.6 mg·kg-1，速效鉀128.0 mg·kg-1。

試驗(yàn)地為含8科11屬14種雜草的東京櫻花（下文簡(jiǎn)稱櫻花）林地（面積1 258.8 m2，郁閉度0.69）及含7科7屬8種雜草的紫薇林地（面積1 080 m2，郁閉度0.26）。其中，櫻花林地雜草主要以牛筋草，香附子，水虱草Fimbristylis littoralis，母草Lindernia crustacea，耳草Hedyotis auricularia，碎米薺Cardamine hirsuta，陌上菜Lindernia procumbens，擬鼠麴草Pseudognaphalium affine，車前Plantago asiatica，通泉草Mazus pumilus，小蓬草Conyza canadensis，匙葉合冠鼠麴草Gamochaeta pensylvanica，球序卷耳Cerastium viscosum，泥花草Lindernia antipoda為主；紫薇林地主要以牛筋草，香附子，水虱草，母草，耳草，馬松子Melochia corchorifolia，馬唐Digitaria sanguinalis，丁香蓼Ludwigia prostrata為主。

2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)《農(nóng)藥田間藥效準(zhǔn)則（一）中除草劑防治林地雜草》（GB/T17980.48-2000）設(shè)計(jì)試驗(yàn)。對(duì)照藥劑為41%草甘膦異丙胺鹽（以下簡(jiǎn)稱草甘膦），濃度為18 mmol·L-1（A）；供試藥劑4,8-DHT濃度分別為9 mmol·L-1（B），18 mmol·L-1（C），36 mmol·L-1（D），以清水為對(duì)照（CK）。櫻花林地小區(qū)面積為50 m2，小區(qū)間隔0.5 m，紫薇林地小區(qū)面積為50 m2，小區(qū)間隔0.5 m，4次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。每小區(qū)用藥（水）量為0.225 L·m-2。

2.4 施藥方法

4,8-DHT林地除草試驗(yàn)時(shí)間為2018年6-9月，試驗(yàn)前期調(diào)查雜草種類及株數(shù)，并進(jìn)行施藥前人工松土，于2018年7月12日雜草萌芽前對(duì)土壤施藥一次，于8月2日對(duì)雜草幼苗莖葉噴施藥一次。試驗(yàn)期間不施用其他任何藥劑。

雜草萌芽前土壤施藥方法：施藥前人工松土，土壤地面噴霧，施藥當(dāng)天（7月12日）晴，施藥后3 d無(wú)雨。

雜草幼苗莖葉噴施藥方法：人工松土20 d后，對(duì)雜草2～ 3葉期的幼苗莖葉噴霧施藥，施藥當(dāng)天（8月2日）晴，施藥后3 d無(wú)雨。

2.5 調(diào)查及統(tǒng)計(jì)方法

在櫻花林地及紫薇林地每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)固定3個(gè)調(diào)查樣方，每個(gè)樣方面積1 m×1 m，施藥后8，12，16，20 d時(shí)觀察雜草生長(zhǎng)情況，用佳能EOS 80D相機(jī)分區(qū)拍照；施藥后8，20 d統(tǒng)計(jì)林地雜草殘存種類及株數(shù)。根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)，利用Excel及SPSS軟件計(jì)算雜草株防治效果（以下簡(jiǎn)稱株防效），并進(jìn)行方差分析及多重比較，通過(guò)雜草覆蓋率大小可判斷雜草防除效果。計(jì)算方法如下：

圖像計(jì)算雜草覆蓋率：根據(jù)拍攝的調(diào)查樣方，Ecognition分類軟件提取雜草面積，計(jì)算雜草的覆蓋率。

3 結(jié)果與分析

3.1 4,8-DHT對(duì)櫻花林地雜草覆蓋率的影響

根據(jù)拍攝的4,8-DHT處理櫻花林地雜草調(diào)查樣方（圖1），計(jì)算櫻花林地雜草覆蓋率，結(jié)果如圖2。4,8-DHT處理后，櫻花林地雜草覆蓋率均有所降低，且具有濃度依賴性，4,8-DHT處理濃度越高，雜草覆蓋率越低。雜草萌芽前對(duì)土壤施藥的雜草覆蓋率明顯低于雜草幼苗莖葉噴施處理，36 mmol·L-14,8-DHT藥后8 d雜草的覆蓋率僅為0.15%，其雜草防除效果優(yōu)于草甘膦。對(duì)雜草幼苗莖葉噴施藥后，雜草覆蓋率降低，但防除效果不明顯（圖2 B）。

圖1 4,8-DHT與草甘膦處理下櫻花林地雜草生長(zhǎng)情況Figure 1 Growth of weeds in C.yedoensis stand treated by 4,8-DHT and glyphosate

圖2 不同施藥處理下櫻花林地的雜草覆蓋率Figure 2 Weeds coverage in C.yedoensis stand treated by 4,8-DHT and glyphosate

3.2 4,8-DHT對(duì)櫻花林地雜草防除的影響

4,8-DHT對(duì)櫻花林地雜草株數(shù)、株防效的調(diào)查結(jié)果如表1。由表1可知，雜草萌芽前對(duì)土壤施藥后，4,8-DHT對(duì)櫻花林地雜草除香附子外均有較高的株防效。藥后8 d，36 mmol·L-14,8-DHT對(duì)陌上菜、擬鼠麴草、車前、碎米薺、匙葉合冠鼠麴草的防除效果顯著（P＜0.05），株防效均高達(dá)100%；藥后20 d，株防效仍為78%以上。對(duì)雜草幼苗莖葉噴施處理藥后8 d，36 mmol·L-14,8-DHT對(duì)碎米薺、匙葉合冠鼠麴草、陌上菜的株防效作用顯著（P＜0.05），分別達(dá)100%，100%，93.8%；藥后20 d時(shí)，株防效仍能保持在87%以上。

3.3 4,8-DHT對(duì)紫薇林地雜草覆蓋率的影響

根據(jù)拍攝的4,8-DHT處理紫薇林地雜草調(diào)查樣方圖（圖3），計(jì)算紫薇林地雜草覆蓋率，結(jié)果如圖4。由圖4可知，在雜草萌芽前進(jìn)行4,8-DHT土壤施藥可降低雜草的覆蓋率，36 mmol·L-14,8-DHT藥后8 d，雜草覆蓋率為0.32%；藥后20 d，雜草覆蓋率僅增長(zhǎng)0.68%；與其余處理相比，36 mmol·L-14,8-DHT施藥后雜草的覆蓋率更低。雜草幼苗莖葉噴施處理20 d后，草甘膦處理的雜草覆蓋率最低，為1.5%；其次為36 mmol·L-14,8-DHT處理，其雜草覆蓋率為2.5%。

圖3 4,8-DHT與草甘膦處理下紫薇林地雜草生長(zhǎng)情況Figure 3 Growth of weeds in L.indica stand treated by 4,8-DHT and glyphosate

3.4 4,8-DHT對(duì)紫薇林地雜草防除的影響

4,8-DHT處理紫薇林地雜草株數(shù)及株防效調(diào)查結(jié)果如表2。從表2可看出，雜草萌芽前土壤施藥，藥后8 d，4,8-DHT抑制紫薇林地內(nèi)母草、耳草的生長(zhǎng)，且隨著處理濃度的增加，防效呈明顯上升的趨勢(shì)，36 mmol·L-14,8-DHT處理的株防效達(dá)到100%。藥后20 d，36 mmol·L-14,8-DHT對(duì)耳草、牛筋草有顯著（P＜0.05）的抑制作用，株防效為100%；其次為水虱草、母草、香附子，株防效分別為66.7%，65.0%，40%，對(duì)馬松子無(wú)防除效果。幼苗莖葉噴施藥后，4,8-DHT各濃度處理對(duì)林地雜草的防除效果較差，藥后20 d，36 mmol·L-14,8-DHT處理對(duì)耳草、牛筋草、母草、馬松子的株防效僅為61.9%，50.0%，48.3%，33.3%，對(duì)香附子和水虱草無(wú)防除效果。不同施藥方法對(duì)紫薇林地雜草的防除效果分析表明，4,8-DHT對(duì)雜草種子萌發(fā)期的抑制作用強(qiáng)于幼苗期，因此4,8-DHT適用于土壤施藥。

3.5 4,8-DHT林地雜草防除效果比較

櫻花及紫薇林地內(nèi)雜草總數(shù)及總株防效調(diào)查結(jié)果如表3。從表3可看出，土壤施藥后20 d，36 mmol·L-14,8-DHT對(duì)櫻花林地中雜草的總株防效為78.5%；與莖葉噴施藥處理相比，總株防效增加13.5%，雜草防除效果顯著。對(duì)紫薇林地雜草莖葉噴施4,8-DHT 20 d后防除效果較差，其中36 mmol·L-14,8-DHT處理雜草的總株防效最高僅為34.6%，而36 mmol·L-14,8-DHT土壤施藥后的總株防效為65.9%。4,8-DHT對(duì)林地雜草防除效果比較可知，4,8-DHT最佳施藥方法為雜草萌芽前土壤施藥。

表3 4,8-DH T與草甘膦處理下櫻花和紫薇林地雜草總數(shù)及總株防效Table 3 Total number and control effect of weed in C.yedoensis and L.indica stands treated by 4,8-DHT and glyphosate

4 小結(jié)與討論

化感物質(zhì)作為除草劑應(yīng)用的一個(gè)顯著特點(diǎn)是具有選擇性和專一性。由天然產(chǎn)物莎草茵為先導(dǎo)化合物開發(fā)的三氟羧草醚田間試驗(yàn)對(duì)一年生雙子葉雜草反枝莧、藜Chenopodium album、狗尾草Setaria viridis具有良好的防除效果[10]；以芳香油纖精酮（leptospermone）為先導(dǎo)化合物開發(fā)的硝磺草酮能有效防除玉蜀黍Zea mays田內(nèi)牛筋草、馬唐、反枝莧等雜草，對(duì)馬齒莧Portulaca oleracea無(wú)防除效應(yīng)[11]；由菊科Compositae植物豬毛蒿Artemisia scoparia全草提取的豬毛蒿精油能顯著防除香附子[12]。本實(shí)驗(yàn)中，高濃度4,8-DHT土壤施藥對(duì)櫻花林地陌上菜、碎米薺、匙葉合冠鼠麴草和紫薇林地耳草的防除效果顯著，中低濃度4,8-DHT莖葉施藥對(duì)香附子、碎米薺、馬松子無(wú)防除效果，本文驗(yàn)證目標(biāo)活性物質(zhì)雜草防除選擇性的同時(shí)獲得了除草劑目標(biāo)作用譜。

除草劑作用于雜草，可抑制雜草的營(yíng)養(yǎng)吸收、物質(zhì)合成、能量代謝、酶活性、光合作用等生理過(guò)程[13]。因抑制生理過(guò)程的不同，除草劑施用方法主要包括土壤施藥法和莖葉噴施法。草甘膦為廣譜型內(nèi)吸滅生型除草劑，遇土鈍化失去活性，適于雜草莖葉噴施[14]；乙草胺為選擇性芽前處理除草劑，主要通過(guò)阻礙蛋白質(zhì)合成來(lái)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，適用于土壤施藥[15]；環(huán)庚草醚土壤施藥與莖葉噴施法均能發(fā)揮其藥效[16]。本試驗(yàn)中，36 mmol·L-14,8-DHT櫻花林地藥后20 d，與莖葉噴施除草效果相比，土壤施藥雜草總株防效增加13.5%；紫薇林地藥后20 d，36 mmol·L-14,8-DHT土壤施藥總株防效為65.9%，比莖葉噴施總株防效增加31.3%。4,8-DHT最高濃度。4,8-DHT對(duì)林地雜草防除效果比較可知，4,8-DHT最佳施藥方法為雜草萌芽前土壤施藥。研究結(jié)果表明，4,8-DHT作為除草劑，施用方法以土壤施藥法為宜。

化感作用強(qiáng)弱不僅取決于植物本身的內(nèi)在因素，環(huán)境因子對(duì)化感作用也具有一定的影響，這可能是解釋以化感物質(zhì)為基礎(chǔ)開發(fā)的生物除草劑在不同林地間除草效應(yīng)存在差異的原因。以天然產(chǎn)物莎草茵所開發(fā)的二苯醚類除草劑氟磺胺草醚對(duì)綠豆Vigna radiata，赤小豆Vigna umbellata及大豆Glycine max田間的鐵莧菜Acalypha australis的防除效果不同，大豆田間鐵莧菜的株防效為84.31%，而綠豆、赤小豆田的鐵莧菜的株防效僅為73.6%[17-18]。本研究中4,8-DHT對(duì)櫻花及紫薇林地內(nèi)雜草的株防效有顯著差異，推測(cè)可能是4,8-DHT從噴施到發(fā)揮除草效果的過(guò)程中多種因素的綜合影響而導(dǎo)致株防效存在差異。環(huán)境因子主要有土壤因素、氣候因素等，影響所施藥劑的吸收及在雜草內(nèi)的轉(zhuǎn)移；生物因素包括林地郁閉度、雜草種類及密度差異也可導(dǎo)致株防效出現(xiàn)差異。本研究?jī)H為特定地域內(nèi)單次試驗(yàn)研究結(jié)果，可能影響到試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，故仍需后續(xù)試驗(yàn)的再次驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果可為4,8-DHT作為生物型除草劑推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也在以天然產(chǎn)物為基礎(chǔ)開發(fā)新型生物農(nóng)藥上起到積極推動(dòng)作用。