山杏葉中角鯊烯提取工藝的研究

彭艷芳，段曉瑋，徐巖巖，李 潔

（河北民族師范學(xué)院 生物與食品科學(xué)學(xué)院，河北 承德，067000）

角鯊烯（Squalene，C 30H 50，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)，是一種高度不飽和烴類(lèi)化合物，最初是在黑鯊魚(yú)Black shark肝油中發(fā)現(xiàn)，是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)免疫力、抗癌、防癌及保濕養(yǎng)顏?zhàn)饔?，廣泛應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥、保健品、食品等行業(yè)[1]。目前提取角鯊烯，多以大鯊魚(yú)Shark肝為原料，資源短缺。因此，尋找新的角鯊烯原料資源是提高角鯊烯產(chǎn)量、降低產(chǎn)品價(jià)格的必要途徑。山杏Armeniaca sibirica是我國(guó)北方荒山綠化樹(shù)種和經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，渾身是寶，山杏仁是生產(chǎn)杏仁露的原料，山杏殼可以加工成活性炭，山杏殼木醋液是綠色農(nóng)用肥的主要原料；民間常以發(fā)酵山杏葉做飼料喂豬，豬生長(zhǎng)快，不生病。研究發(fā)現(xiàn)，山杏葉中含有大量黃酮、三萜類(lèi)生物活性物質(zhì)[2]，張婷等[3]發(fā)現(xiàn)山杏葉40%乙醇提取物抗氧化活性最高。李潔等[4]在蛋雞飼料中添加0.3%的山杏葉發(fā)酵物，可提高蛋雞產(chǎn)蛋量，降低蛋殼破損率和料蛋比。我國(guó)山杏資源豐富，從山杏綜合利用的角度出發(fā)，進(jìn)一步研究山杏葉的成分及功能十分必要。

本研究以山杏葉為材料，采用SEF-CO2（CO2超臨界萃取法）法提取山杏葉油，在GC-MS成分分析的基礎(chǔ)上，對(duì)提取其中角鯊烯的溶劑、條件進(jìn)行研究，以期建立最佳提取工藝，為山杏葉的深加工和綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 試驗(yàn)用山杏葉于2016年10月10日采自河北省承德市羅漢山，分別從4棵山杏樹(shù)（樹(shù)齡約20 a，胸徑約10 cm） 的東西南北四個(gè)方向各采摘約200 g老葉，混合均勻。一部分葉片于鼓風(fēng)干燥箱120℃殺青5 min，于70℃烘干至恒質(zhì)量，然后用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩，所得樣品用于山杏葉油的制備；另一部分葉片放在通風(fēng)良好的室內(nèi)自然干燥至含水量約5%，粉碎，過(guò)20目篩，將處理好的樣品放在干燥器中用于山杏葉角鯊烯提取工藝研究。

1.1.2 試劑 30～60℃沸程的石油醚、60～90℃沸程的石油醚、環(huán)己烷均為分析純；角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 TRACE MS 2000型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Finnigan公司）。FA1204B電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；榮華HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；安捷倫（Agilent）7820型氣相色譜儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山杏葉油的制備 山杏葉油的制備采用SEF-CO2法。稱(chēng)取10 g干燥好的山杏葉樣品放入脫脂棉布小袋中，封好口；于40℃，27.58 MPa條件下提取2 h，提取結(jié)束后，將提取物收集在小玻璃瓶中封口，保存在4℃的冰箱中，以便進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.2 GC-MS條件 DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 um)。氣化溫度280℃；升溫程序：初始溫度80℃（1 min），以5℃·min-1升溫速率升至150℃，再以3℃·min-1升溫速率升至180℃，然后以7℃·min-1升溫速率升至260℃，維持20 min；載氣流量1.0 mL·min-1。EI電離源，離子源溫度200℃；掃描質(zhì)量范圍m/z（質(zhì)子數(shù)/電荷數(shù)的比值）40～610。

1.2.3 氣相色譜條件 Agilent色譜柱HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 um）上分離，進(jìn)樣口溫度為300℃，火焰離子化檢測(cè)器（FID）溫度300℃，柱溫270℃，載氣流速2 mL·min-1。

1.2.4 角鯊烯標(biāo)液 精密稱(chēng)取角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品32.8 mg，用石油醚溶解，用10 mL容量瓶定容，濃度為3.28 mg·mL-1，將其稀釋?zhuān)来蔚玫?.328，0.164 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)氣相色譜儀檢測(cè)，得到山杏葉角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度與峰面積應(yīng)成線性關(guān)系。

1.2.5 單因素試驗(yàn) 以山杏葉角鯊烯的含量為考察指標(biāo)，分別對(duì)提取時(shí)間、料液比、提取溫度、提取溶劑4個(gè)影響提取率的因素進(jìn)行考察，設(shè)定提取時(shí)間分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h；料液比分別為1:2，1:4，1:6，1:8，1:10（g·mL-1），提取溫度分別為50，60，70，80，90℃，提取溶劑分別為60～90℃的石油醚，30～60℃的石油醚，環(huán)己烷，每組重復(fù)3次平行實(shí)驗(yàn)，取其平均值。固定的單因素條件為提取時(shí)間2 h、料液比1:4（g·mL-1）、提取溫度60℃、提取溶劑60～90℃的石油醚。

1.2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間、料液比、提取溫度3個(gè)因素建立3因素3水平的正交試驗(yàn)，以山杏葉角鯊烯含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)一步選取最佳工藝條件。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal test design of three factors and three levels

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行作圖、數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山杏葉中角鯊烯的鑒定

采用SEF-CO2制備山杏葉油，用GC-MS進(jìn)行成分分析（見(jiàn)圖1、圖2），從山杏葉中共檢出79個(gè)色譜峰，鑒定出20個(gè)化合物，其中角鯊烯（38.49%）＞烷烴（9.36%）＞不飽和脂肪酸（9.1%）＞酯類(lèi)（6.96%）＞植醇（3.71%），可見(jiàn)山杏葉油中以角鯊烯為主要成分，含量較高。

圖1 山杏葉油總離子流色譜圖( t=39.97)Figure 1 Total ion current chromatogram of oil from A.sibirica leaves

圖2 質(zhì)譜庫(kù)中角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖（A）與t=39.97色譜峰質(zhì)譜圖（B）的比較Figure 2 Comparison on mass spectrum of squalene between standard and t=39.97 chromatographic peak (Figure 1)

2.2 山杏葉角鯊烯提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 最佳提取時(shí)間 由圖3可知，提取液中山杏葉角鯊烯的含量隨著提取時(shí)間的增加而呈上升趨勢(shì)，這是由于隨著提取時(shí)間的增加，山杏葉角鯊烯大量遷移出，在1.0～2.5 h山杏葉角鯊烯遷移速度較快，超過(guò)2.5 h后角鯊烯遷移速度放慢，說(shuō)明山杏葉中大部分內(nèi)角鯊烯在2.5 h左右就已遷移出，為了盡可能的多提取出山杏葉中的角鯊烯，因此確定最佳的提取時(shí)間為3.0 h。

2.2.2 最佳料液比 由圖4可知，提取液中山杏葉角鯊烯的含量隨著料液比的增加而增加，在料液比≥1:8時(shí)，山杏葉中角鯊烯的含量趨于穩(wěn)定。分析其原因是由于當(dāng)料液比較低時(shí)，固液體系間有效成分的濃度差隨著料液比的提高而增大，更有利于傳質(zhì)。由此確定超聲處理的最佳料液比為1:8。

圖3 提取時(shí)間對(duì)山杏葉角鯊烯提取量的影響Figure 3 Effect of extraction duration on squalene yield

2.2.3 最佳提取溫度 由圖5可得出，當(dāng)提取溫度在50～60℃時(shí)，提取液中山杏葉角鯊烯的含量隨著溫度的升高而增加，這是因?yàn)樵跍囟容^低時(shí)，升溫有利于山杏葉角鯊烯在石油醚中的溶解；提取溫度在60～90℃時(shí)，提取液中山杏葉角鯊烯的含量隨著溫度的升高而減少，角鯊烯的沸點(diǎn)為285℃，對(duì)溫度非常穩(wěn)定，理論上，60～90℃升溫同樣應(yīng)該有利于山杏葉角鯊烯的溶解移出，但提取液中山杏葉角鯊烯的含量反而減少，這可能是山杏葉中含有氧化物質(zhì)，在提取過(guò)程中一部分角鯊烯被氧化消耗掉[5]，使得角鯊烯的含量減少。因此，確定超聲提取溫度為60℃。

2.2.4 最佳提取溶劑 根據(jù)圖6得出，提取溶劑為石油醚60～90℃時(shí)，提取液中山杏葉角鯊烯的含量最高，其次為石油醚30～60℃，環(huán)己烷提取效果最差。高貴桃等[6]對(duì)甘草Glycyrrhiza uralensis綜合利用中角鯊烯提取工藝的研究表明石油醚的提取效果好于正己烷（環(huán)己烷與正己烷性質(zhì)類(lèi)似）。另外考慮到石油醚30～60℃在室溫下即可氣化，對(duì)溫度非常敏感，因此，確定最佳提取溶劑為石油醚60～90℃。

圖4 料液比對(duì)山杏葉角鯊烯提取量的影響Figure 4 Effect of solid-liquid ratio on squalene yield

圖5 提取溫度對(duì)山杏葉角鯊烯提取量的影響Figure 5 Effect of extraction temperature on squalene yield

圖6 提取溶劑對(duì)山杏葉角鯊烯提取量的影響Figure 6 Effect of extraction solvent on squalene yield

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

以提取時(shí)間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）三個(gè)因素為自變量，經(jīng)水浴冷凝后提取液中山杏葉角鯊烯含量為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)方案和結(jié)果如表2，從表2可見(jiàn)，各因素對(duì)提取液中山杏葉角鯊烯含量影響的大小次序?yàn)椋篊> B > A，即提取溫度影響最大，料液比其次，提取時(shí)間影響最小。綜合各因素的K值比較，計(jì)算得出山杏葉角鯊烯最佳提取工藝條件為C1B3A1，即提取溫度為60℃、料液比為1:10、提取時(shí)間為2.5 h；而直接觀看得到的最佳工藝條件為第6號(hào)試驗(yàn)，即C1B3A2。因素C，B直接觀看與計(jì)算結(jié)果皆一致，因素A直接觀看與計(jì)算結(jié)果不一致，直接觀看因素A，第二水平最好，即3.0 h，而計(jì)算結(jié)果因素A采用第一水平時(shí)最好，即2.5 h。

表2 正交試驗(yàn)L9（33）及結(jié)果Table 2 Orthogonal test L9（33）and results

2.4 正交驗(yàn)證試驗(yàn)

由于直接觀看得到的最佳工藝條件（C1B3A2）與計(jì)算所得出的最佳提取工藝條件（C1B3A1）不一致，因此需對(duì)上述兩種提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果表明，直接觀看的最佳工藝條件C1B3A2得到的山杏葉角鯊烯含量為2.11 mg·g-1，計(jì)算所得的最佳提取工藝條件C1B3A1得到的山杏葉角鯊烯含量為2.08 mg·g-1；F檢驗(yàn)表明，兩者之間不存在顯著性差異。從極差R值來(lái)看，提取時(shí)間對(duì)提取液中山杏葉角鯊烯含量影響極小；再?gòu)纳a(chǎn)上節(jié)約原材料、降低成本角度考慮，提取時(shí)間以2.5 h為好。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到山杏葉角鯊烯最佳提取工藝條件：提取溶劑為石油醚60～90℃，提取溫度為60℃，料液比為1:10，提取時(shí)間為2.5 h。由最佳提取工藝提取出的山杏葉中角鯊烯含量最高可達(dá)2.19 mg·g-1，折合百分率為0.219%。

目前，角鯊烯的主要生產(chǎn)原料是深海鯊魚(yú)的肝臟，由于資源有限，致使其商品價(jià)格昂貴。尋找新的角鯊烯生產(chǎn)原料至關(guān)重要。有研究者報(bào)道一些植物油脂中含有角鯊烯，如省沽油Staphylea bumalda籽油中角鯊烯含量可達(dá)6.5%[7]，莧屬Amaranthus植物的種子油中為4.9%[8]，橄欖Canarium album油中為0.7%[9]，而這些研究的材料均為植物種子油，需要先榨油再提取角鯊烯，工藝復(fù)雜、成本高。目前尚未有山杏葉提取角鯊烯的相關(guān)報(bào)道，以山杏秋天老葉為原料提取角鯊烯，一方面促進(jìn)了山杏資源的綜合利用，加長(zhǎng)了山杏的產(chǎn)業(yè)鏈；另一方面也拓寬了角鯊烯生產(chǎn)的原料來(lái)源，對(duì)保護(hù)深海鯊魚(yú)資源，維護(hù)海洋生態(tài)平衡具有重要意義。