AMPA受體在新生大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元興奮毒性中的表達(dá)*

葉文華 陳慧英 韋芳玉 林曉宇 劉金蘭 易健啟 葉莞麗 蘇紀(jì)平

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選取新生3天的SPF級SD大鼠10只(由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，雌雄不分)，分為免疫熒光染色組、正常對照組、SS組、AMPAR激動劑組(AMPA組)及AMPAR拮抗劑組(CNQX組)，每組2只。

1.2主要儀器及試劑 CO2培養(yǎng)箱購于Thermo Fisher公司，倒置顯微鏡及熒光顯微鏡購于奧林巴斯公司；FQ-PCR 反應(yīng)儀Stepone Plus購于美國ABI公司；青-鏈霉素溶液(濃度為100 IU/ml)購于上海生工生物工程有限公司；B27添加劑(50X)購于Thermo Fisher公司；DMEM-F12(1∶1)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)購于Gibco公司；水楊酸鈉、4%多聚甲醛、Tritonx-100、山羊血清購于Sigma公司；FQ-PCR 試劑盒及相關(guān)試劑購于Invitrogen公司；鼠抗βⅢ-Tubulin、兔抗AMPA receptor A2購于Abcam公司；Alexa-594、Alexa-488購于CST公司。

1.3實驗方法

1.3.1新生SD大鼠SGN原代培養(yǎng)及水楊酸鈉處理[4]SD大鼠用75%乙醇消毒后斷頭，取雙側(cè)顳骨置于4 ℃ PBS平衡鹽液中，在解剖顯微鏡下，分離出完整的耳蝸，剔除螺旋韌帶和基底膜，留取完整的蝸軸(即SGN所在部位)，分成兩部分備用。一部分用于提取RNA；另一部分獲取SGN，培養(yǎng)48 h后更換正常培養(yǎng)基和含0.5 mM SS和5 mM SS的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，分別處理30 min、1 h、3 h、6 h。

1.3.2SGN中AMPAR GluA2亞單位免疫熒光染色 SGN培養(yǎng)48 h后，移除培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次(3分鐘/次)；加入4%多聚甲醛固定15 min；移除固定液并用PBS洗滌3次(3分鐘/次)，加入0.2% Tritonx-100通透液室溫孵育10 min；移除通透液并用PBS洗滌3次(3分鐘/次)，然后用5%山羊血清封閉30 min，移除封閉液，分別滴加鼠抗βⅢ-Tubulin(一抗，1∶300)和兔抗AMPA 受體GluA2(一抗，1∶100)，于4℃孵育過夜；移除一抗，用PBS洗滌3次(3分鐘/次)，分別滴加Alexa-594標(biāo)記山羊抗鼠IgG(二抗，1∶500)，Alexa-488標(biāo)記山羊抗兔IgG(二抗，1∶500)；避光孵育30 min；移除二抗，用PBS洗滌3次(3分鐘/次)；滴加抗熒光淬滅劑封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3RNA提取和cDNA合成及FQ-PCR檢測基因表達(dá) 依據(jù)Invitrogen 公司Trizol試劑盒說明書提取總RNA，核酸定量檢測儀檢測RNA濃度及OD比值。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳確定總RNA的完整性及降解情況。按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，確定cDNA產(chǎn)物正確后，保存于-20 ℃冰箱備用。采用SYBR Green I 嵌合熒光法，參照FQ-PCR 試劑盒(Invitrogen，美國)說明，以GAPDH為內(nèi)參，使用FQ-PCR 反應(yīng)儀Stepone Plus(ABI，美國)進(jìn)行熒光定量檢測。每個樣品均設(shè)3個復(fù)孔，所有樣品均設(shè)陰性對照以排除污染所導(dǎo)致的假陽性結(jié)果；做標(biāo)準(zhǔn)曲線，確保擴(kuò)增效率一致。反應(yīng)結(jié)果用Ct值表示，Ct值是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(threshold cycle)，Ct值越大，參加反應(yīng)的起始模板量就越小，反之亦然。SGN中AMPAR各亞單位mRNA相對表達(dá)量用△Ct表示，計算公式為相對mRNA表達(dá)量=2-△Ct；在水楊酸鈉實驗中，假定各時間點未用含水楊酸鈉的培養(yǎng)基處理的SGN為對照組，基因表達(dá)量為1，用2-△△Ct法對AMPAR各亞單位mRNA相對表達(dá)量進(jìn)行比較，計算公式為：①△Ct=Ct目的基因-Ct管家基因；②△△Ct=△Ct處理組-△Ct對照組；③相對表達(dá)量=2-△△Ct，2-△△Ct值與mRNA的相對表達(dá)量成正比。實驗所用引物均由Invitrogen公司合成，引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

1.3.4Western Blot檢測AMPAR亞單位CluA2表達(dá) 按照Mem-PERTMPlus Membrane Protein Extraction Kit (Thermo Scientific) 說明書進(jìn)行細(xì)胞膜蛋白提取；RIPA裂解液冰上裂解30 min 獲取細(xì)胞總蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度，高溫加熱使蛋白變性；8% SDS-PAGE 凝膠電泳，每孔加入60 μg 蛋白樣品，根據(jù)marker(碧云天生物技術(shù)，海門)分子量大小進(jìn)行切膠。100 mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)膜100 min (GluA2, 100 kDa)，而后室溫下用5% BSA 封閉PVDF膜1.5 h。用兔抗小鼠GluA2抗體和兔抗小鼠βⅢ-Tubulin抗體于4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后用山羊抗兔熒光二抗室溫下孵育1.5 h，TBST洗滌后用Odyssey紅外掃膜儀(LI-COR，美國)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，用ImageJ 軟件測量條帶灰度值，以βⅢ-Tubulin蛋白作為內(nèi)參，蛋白相對表達(dá)量=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。(WB用抗體均來自Abcam)。

2 結(jié)果

2.1免疫熒光染色觀察SGN中AMPAR GluA2表達(dá) SGN原代培養(yǎng)48 h呈現(xiàn)出胞體橢圓形或圓形、細(xì)胞表面光亮等特征。采用βⅢ-Tubulin陽性染色，SGN呈現(xiàn)出紅色熒光，胞體和軸突均可見明顯的紅色熒光(圖1a)；AMPAR GluA2陽性染色，呈現(xiàn)綠色熒光，胞體染色較軸突更為明顯(圖1b)；將圖1a和圖1b進(jìn)行融合，呈現(xiàn)出黃色熒光(圖1c)，提示正常SGN原代培養(yǎng)48 h，其上有AMPAR GluA2表達(dá)。

圖1 熒光顯微鏡下SGN中AMPAR GluA2亞單位免疫熒光顯示 a. βⅢ-Tubulin陽性染色,呈紅色熒光;b. AMPAR-A2陽性染色,呈現(xiàn)綠色熒光;c. 圖片融合,SGN中AMPAR GluA2亞單位表達(dá)

2.2SGN與大腦皮層神經(jīng)元中AMPAR各亞單位mRNA相對表達(dá)量 SGN中有AMPAR A1～A4亞單位表達(dá)，各亞單位之間進(jìn)行比較，表達(dá)量由高到低排序為A3>A2，A3>A4，A2和A4>A1；大腦皮層神經(jīng)元中亦有A1～A4亞單位表達(dá)，表達(dá)量排序為A2>A3>A1>A4(表2)。AMPAR在SGN及大腦皮層神經(jīng)元中的相對表達(dá)量用△Ct值表示，△Ct值與mRNA的相對表達(dá)量成反比。

表2 AMPAR各亞單位mRNA在SGN及大腦皮層神經(jīng)元中相對表達(dá)量

2.30.5 mM SS作用SGN后AMPAR各亞單位mRNA的相對表達(dá)量變化 0.5 mM SS作用SGN后，AMPAR各亞單位在不同時間點，0.5 mM SS處理組與正常對照組(0.5 mM SS處理0 min)之間mRNA表達(dá)量差異見表3，其中A2在30 min時表達(dá)量明顯降低, 為0.558 1±0.068 3(P<0.05)，其它時間點A2表達(dá)量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；其余亞單位在0.5 mM SS作用不同時間點的mRNA表達(dá)量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 0.5 mM SS作用SGN不同時間點AMPAR A1～A4亞單位在正常對照組和SS組中mRNA表達(dá)量變化

2.45 mM SS作用SGN后AMPAR各亞單位mRNA的相對表達(dá)量變化 5 mM SS作用SGN后，AMPAR各亞單位在不同時間點，5 mM SS處理組與正常對照組(5 mM SS處理0 min)之間mRNA表達(dá)量差異見表4，其中A1在5 mM SS作用30 min時表達(dá)量降低，隨后緩慢升高；A2和A3在5 mM SS處理不同時間點都呈現(xiàn)出明顯降低趨勢；A4在5 mM SS處理不同時間點呈現(xiàn)出以降低為主的趨勢。

表4 5 mM SS作用SGN不同時間點AMPAR A1～A4亞單位在正常對照組和SS組中mRNA表達(dá)量

2.55 mM SS作用SGN 30 min后GluA2亞單位蛋白表達(dá)量變化 與正常對照組(SS處理0 min)相比較，5 mM SS作用SGN 30 min 后，A2膜蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而A2總蛋白無明顯改變(圖2及表5)。與正常對照組比較，AMPA(AMPAR激動劑)組、5 mM SS組、5 mM SS+AMPA組A2膜蛋白相對表達(dá)量均降低(均為P<0.05)、5 mM SS+CNQX組(AMPAR拮抗劑)，5 mM SS+AMPA處理組+CNQX組與CNQX組A2膜蛋白相對表達(dá)量均無明顯改變。表明，SS和AMPA均可刺激SGN表面AMPAR內(nèi)化，抑制AMPAR后，SS對AMPAR的內(nèi)化作用被逆轉(zhuǎn)。

表5 5 mM SS作用SGN 30 min后各組AMPARA2亞單位膜蛋白及總蛋白表達(dá)量

圖2 5 mM SS作用SGN 30 min后AMPA受體A2亞單位膜蛋白及總蛋白表達(dá)量變化(x±s)(n=6)

3 討論

功能型AMPAR是由四種亞單位(GluA1～A4)組成的四聚體受體，主要分布于興奮性神經(jīng)元突觸后膜上，其組合形式主要有GluA1/2、GluA2/3

和GluA3/4三種，并大多數(shù)以GluA1/2和GluA2/3的組合形式發(fā)揮作用[5]。本研究顯示，新生大鼠SGN中AMPAR各亞單位的表達(dá)量變化呈現(xiàn)出A3>A2、A3>A4、A2和A4>A1的趨勢，在大腦皮層神經(jīng)元中AMPAR各亞單位的表達(dá)量變化呈現(xiàn)出A2>A3>A1>A4的趨勢，據(jù)此推測AMPAR各亞單位表達(dá)量高低變化可能與其分布部位和功能有關(guān)。有研究報道，出生1天的SD大鼠，其內(nèi)外毛細(xì)胞相關(guān)的傳入神經(jīng)纖維末梢有A2和A3表達(dá)，而在之后的2周內(nèi)，A2和A3隨著發(fā)育不斷被下調(diào)以交換A4的生成[6, 7]；而在大腦皮層神經(jīng)元中A2 和A3在胚胎期第18天出現(xiàn)，生后10～15天達(dá)到峰值，出生30天后下降到出生時水平[8, 9]。本研究中亦發(fā)現(xiàn)，SGN及大腦皮層神經(jīng)元中A2和A3的相對表達(dá)量均較高，說明A2和A3更為重要。在Meng等[10]的研究中發(fā)現(xiàn)，A3基因缺失對海馬長時程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)和長時程抑制(long-term depression,LTD)沒有明顯影響；在Kessels和賈正平等[11, 12]的研究中發(fā)現(xiàn)A3與運(yùn)動學(xué)習(xí)密切相關(guān)，這種功能的發(fā)揮需要與A2相結(jié)合，并且主要與A3介導(dǎo)的LTP通道特性改變有關(guān)，而與受體轉(zhuǎn)運(yùn)無關(guān)；這些研究亦提示A3可能主要起輔助作用。A4在SGN發(fā)育過程中不斷變化或被其他亞單位轉(zhuǎn)化的特性，使其在SS處理后表達(dá)量變化趨勢不如A2和A3有規(guī)律性。從文中結(jié)果看，A1的Ct值在33.767～36.9519之間，表明參加反應(yīng)的起始模板量極少，故而不對A1做討論。

Michael等[13]在有關(guān)受體轉(zhuǎn)運(yùn)的研究中發(fā)現(xiàn)使用苦參毒素(picrotoxin)刺激后，30 min內(nèi)大部分的AMPAR已發(fā)生內(nèi)化，而此時只有極少數(shù)的NMDAR發(fā)生內(nèi)化。Marina等[14, 15]的研究表明多巴胺受體第一家族的激動劑(SKF 81297)作用中樞神經(jīng)元后，短時間(30 min內(nèi))便可增加AMPAR表面表達(dá)，這表明AMPAR在短時間內(nèi)便可發(fā)生受體轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)SS作用30 min時SGN中AMPAR各亞單位mRNA的表達(dá)量呈劇烈波動，其中A2反應(yīng)最明顯，A2的膜蛋白表達(dá)量亦顯著下降。提示無論在受體轉(zhuǎn)運(yùn)層面或是在基因轉(zhuǎn)錄層面，AMPAR多方面介導(dǎo)了SGN興奮毒性。耳毒性相關(guān)研究中，SS可引起SGN可逆性的興奮毒性損傷，同時SS可刺激受體，使受體在電生理功能、蛋白、基因不同層面發(fā)生相應(yīng)改變，因而成為目前研究受體機(jī)制介導(dǎo)耳毒性較理想的工具。

在SGN興奮毒性機(jī)制的研究中，NMDAR的作用比較明確，而AMPAR的作用機(jī)制研究仍較缺乏，因此探討AMPAR在SGN興奮毒性中的作用十分必要。相較于AMPAR在SGN興奮毒性中的表達(dá)明顯下降，其在大腦皮層神經(jīng)元興奮毒性中表達(dá)量有升高有降低，Szczurowska等[16]研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作期間，額葉皮層和背側(cè)海馬中A2亞單位的mRNA及蛋白表達(dá)量明顯增加，而腹側(cè)海馬中A2亞單位的mRNA及蛋白表達(dá)量明顯降低，表明在大腦皮層神經(jīng)元興奮毒性損傷中AMPAR mRNA及蛋白的表達(dá)水平具有明顯的區(qū)域特性。其可能機(jī)制是AMPAR的磷酸化與去磷酸化觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)CaMKII通路及cAMP-PKA通路。研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作期間，A1亞單位上Ser831和Ser845位點的去磷酸化伴隨著AMPAR內(nèi)吞作用，使AMPAR表達(dá)減少；A1亞單位的Ser831位點和A2亞單位的Ser880位點磷酸化，AMPAR表面表達(dá)增加，而Ser831位點受CaMKII通路調(diào)節(jié)，Ser845位點及Ser880位點受cAMP-PKA通路調(diào)節(jié)[17,18]。并且眾多文獻(xiàn)[19]證實，去磷酸化可啟動AP-2-Dynamin-Clathrin (Adaptor Protein 2- Dynamin-Clathrin，接頭蛋白2-發(fā)動蛋白-網(wǎng)格蛋白)一系列的細(xì)胞骨架系統(tǒng)。因而提示，在SS致AMPAR的mRNA劇烈變化及胞膜表面受體內(nèi)化介導(dǎo)SGN興奮毒性的過程中，AMPAR A1,A2亞單位的去磷酸化與細(xì)胞骨架系統(tǒng)介導(dǎo)的受體轉(zhuǎn)運(yùn)，是重要的可能機(jī)制。故而推測AMPAR在SGN興奮毒性中表達(dá)下降，其機(jī)制可能涉及：①SS可直接抑制興奮性受體的表達(dá)；②SS能致SGN興奮毒性，NMDAR興奮性升高，為維持細(xì)胞興奮抑制的平衡，下調(diào)AMPAR的表達(dá)；③興奮毒性的發(fā)生，AMPAR去磷酸化，A2表達(dá)減少，加劇神經(jīng)元的死亡，受體表達(dá)減少。

綜上所述，新生大鼠SGN中存在AMPAR的表達(dá);AMPAR各亞單位mRNA表達(dá)量在SS作用后均表現(xiàn)為下降，其中A2亞單位膜蛋白表達(dá)量顯著降低，表明SS可促進(jìn)AMPAR內(nèi)化，具體作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。