絲素蛋白//殼聚糖//羥基磷灰石膜具有好的生物相容性及促成骨性能

全君杰，羅 剛，李志容，梁二妹

1珠海市香洲區(qū)香灣社區(qū)衛(wèi)生服務中心口腔科，廣東 珠海 519000；2廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，廣東 廣州510120

引導骨再生技術在口腔頜面骨缺損中已廣泛運用，屏障膜材料在引導骨再生技術上具有關鍵作用，臨床上已有在使用的各類生物膜材料，但各有物化性能不佳、引導骨再生能力不足及細胞粘附不佳等缺點，絲素蛋白（SF）和殼聚糖（CS）均是天然高分子材料，有較多研究表明SF和CS具有良好的引導骨再生的能力［1-3］。有研究將SF做成三維多孔SF支架用于骨組織工程研究［4］，先將骨髓間充質干細胞植入支架，再植入鼠頭蓋骨創(chuàng)傷模型上，說明SF可用于骨重建和再生，表現(xiàn)出機械穩(wěn)定性和持久性。然而，單純的SF支架還有很多缺點，如其機械性能不佳，成形困難，親水性差和降解緩慢等。載有生長因子的CS膜可以明顯促進骨的再生［5-6］。由CS制成的單純CS生物材料在運用時，具有機械性能較差，在中性溶液中狀態(tài)不穩(wěn)定等缺陷，就需要將CS進行修飾或者與其它材料復合以改善性能［7］，構建有骨誘導性的骨組織工程材料。HA晶體是構成人體自然骨的重要組成部分［8］，SF∕羥基磷灰石（nHA）材料的構建有效地改善了nHA的機械強度，在誘導骨再生方面也有一定效果［9-10］。將CS與nHA復合，構建適合骨組織工程的生物材料，這種復合材料有一定的韌性和可塑性，并有一定誘導骨再生能力［11-12］。但是上述復合材料還存在力學強度低，降解速率與機體組織在其表面的生長速率不匹配等問題。目前，鮮有研究將以上3種材料符合制備生物膜來研究3種材料復合后對于促進成骨細胞生長的影響，本研究運用SF，CS和HA制備復合生物膜，將MG-63細胞與復合生物膜在體外共同培養(yǎng)，以了解其成骨性能。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器

SF粉末（浙江湖州新天絲生物技術有限公司），平均粒徑2.5 μm；CS（脫乙酰度＞90%），HA（上海博奧生物科技有限公司），乙醇、醋酸等均為分析純。CCK-8檢測試劑盒，硝基苯磷酸鹽試劑（Sigma，美國）。

1.2 復合生物膜的制備

將SF和CS溶于1%（v/v）醋酸配成酸性溶液，調pH至5.0。配置1 mol的硝酸鈣溶液和0.6 mol的磷酸氫二銨溶液，將HA逐滴加入溶液中（單純的SF/CS復合膜不加入HA），反應溫度控制在4℃，pH控制在6.0。攪拌反應2 h后，復合材料漿料在室溫下放置至少4 h除去氣泡，澆鑄在平板上成膜，室溫下?lián)]發(fā)溶劑48 h,用去離子水反復洗滌，即得到SF/CS/n-HA及單純的SF/CS復合膜，復合膜鋪在平板上干燥備用。

1.3 復合生物膜的電鏡檢測

取適量的膜材料置于電子顯微鏡載物臺上，真空下噴金，觀察期表面形態(tài)。

1.4.1 實驗分組 以冷沉淀法制備2組復合膜，實驗組采用SF/CS/n-HA膜，對照組采用SF/CS膜，空白組使用載玻片。

1.4.2 實驗材料的準備 將實驗組和對照組的復合膜裁切制備成邊長1 cm，厚度0.5 cm的正方形片，空白組使用市售載玻片裁切成邊長為1 cm的正方形，以60Co消毒滅菌備用。

1.4.3 細胞接種 將3組材料置于無菌培養(yǎng)皿中，加入75%酒精溶液消毒處理30 min，PBS緩沖液(pH 7.4)充分浸泡1 h，中間換液以保證交換出所有殘留酒精。然后置于紫外燈下照射30 min，自然風干。滅菌后的材料用DMEM培養(yǎng)液(20%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)浸泡24 h，移入12孔無菌培養(yǎng)板。取500 μL人骨肉瘤細胞（MG63）細胞懸液(1.0×105/mL)接種于含試樣的培養(yǎng)板中，在37℃、飽和濕度、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，再于每孔加入1 mL DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)板置于37℃、飽和濕度、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，次日換液，以后隔日換液1次。

1.4 復合生物膜的細胞實驗

1.4.4細胞粘附率的測定 分別在細胞接種培養(yǎng)1、4、7 h后，將試樣從培養(yǎng)液中取出，用PBS緩沖液（pH 7.4）沖洗2次，去除死細胞，移入96孔板，每孔加入新鮮培養(yǎng)基100 μL，避光加入CCK-8 10 μL，用吸管輕輕吹打數(shù)次，培養(yǎng)板置于37℃恒溫箱培養(yǎng)2 h后，吸取100 μL加入96孔板，置于酶標儀內于波長490 nm處測量各孔的吸光度A490nm值。

1.4.5 細胞粘附率的測定 分別在細胞接種培養(yǎng)1、3、5 d后，用PBS緩沖液（pH 7.4）沖洗2次，以去除死細胞，移入96孔板，每孔加入新鮮培養(yǎng)基100 μL，避光加入CCK-8 10 μL，用吸管輕輕吹打數(shù)次，培養(yǎng)板置于37℃恒溫箱培養(yǎng)2 h后，吸取100 μL加入96孔板，置于酶標儀內于波長490 nm處測量各孔的吸光度A490nm值。

1.4.6 堿性磷酸酶(ALP)活性測試 將接種培養(yǎng)7、14、21 d后的試樣從培養(yǎng)液中取出，用PBS緩沖液（pH 7.4）沖洗2次，加入700 μL消化液消化3～5 min，用吸管輕輕吹打數(shù)次。再加入含血清培養(yǎng)基終止消化，充分擠出支架中液體后，離心收集細胞。以PBS緩沖液（pH 7.4）漂洗細胞，再加入200 μLTritonX-100(2%)細胞裂解液，置于4℃冰箱裂解24 h。取裂解液100 μL加入96孔板，避光滴加配置好的磷酸對硝基苯酯每孔200 μL于恒溫培養(yǎng)箱培育30 min后取出，用酶標儀測定細胞裂解液在405 nm處的光密度A405nm值。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，對數(shù)據(jù)行析因方差分析，對每個時間段進行組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 電鏡結果

兩組復合生物膜中，SF/CS/nHA與SF/CS生物膜的均有孔隙結構，而SF/CS/nHA的孔隙直徑略大于SF/CS，其孔隙分布情況也較為均勻（圖1）。

2.2 細胞黏附率

結果顯示，3組的MG-63細胞黏附率均隨著接種時間增加而增高，各組間的差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）；實驗組及對照組在3個時間段內，均高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗組的細胞黏附率在各個時間段內也均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 3組3個時間點MG63細胞的黏附比較Tab.1 The absorbance values of cell adhesion at three time points of three groups(Mean±SD)

2.3 細胞增殖情況

3組細胞的增殖率隨時間的增加而增加，在3個時間段內，實驗組及對照組均高于空白組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表2）。第3天實驗組的細胞增殖率高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；第1天和第5天，實驗組與對照組的細胞增殖率的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 3組3個時間點MG63細胞的增殖情況比較Tab.2 Comparison of proliferation rate of MG-63 on different membranes at three time points of three groups(Mean±SD)

2.4 復合膜上MG-63細胞的ALP活性

結果顯示，MG-63細胞產(chǎn)生的ALP會隨著時間的增加而增加。在3個時間段內，實驗組及對照組的ALP均高于空白組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表3）；實驗組的ALP也均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 3組3個時間點MG63細胞的ALP活性比較Tab.3 Comparision of alkaline phosphatase activity of MG-63 cells at different membranes(Mean±SD)

3 討論

在臨床上已有部分成品生物膜材料運用在骨缺損及骨引導再生修復上，理想的生物膜材料應該具有與軟組織接觸面能起到阻擋纖維細胞長入骨缺損處形成瘢痕愈合，與骨組織面接觸的生物膜面應該具有能引導成骨細胞長入骨缺損及生物膜上，并在一定程度上能促進骨組織的再生［13-14］。國內外有較多文章對SF、CS及HA進行研究，這3種材料對于成骨細胞均具有一定引導其增殖及誘導其成骨性能，但是少有研究對于這3種材料進行復合，并進行體外細胞實驗來研究其引導骨再生的性能。

細胞的黏附率是細胞在一個介質上生長及增殖的第一步，有研究發(fā)現(xiàn)間充質干細胞可以通過膠原模擬多肽（DGEA和PA）和Ⅰ型膠原蛋白粘附于HA上，并促進了成骨標志物的表達［15］，他們認為通過模擬多肽和Ⅰ型膠原蛋白不僅促進了成骨細胞對于HA的粘附，而且還促進了成骨細胞的分化，以達到HA的骨整合作用。本研究也發(fā)現(xiàn)MG-63細胞在實驗組的黏附率及增殖率均高于對照組及空白組，在黏附率實驗中，實驗組的細胞黏附率高于對照組及空白組?？赡苁荋A的加入誘導了MG-63細胞加速粘附在了實驗組中［16］，實驗組級對照組均高于空白組，所以無論是SF/CS膜還是SF/CS/nHA膜均具有較為安全的生物相容性。

有研究發(fā)現(xiàn)在聚乙二醇水凝膠中加入nHA，其中加入1%質量比的nHA，成骨細胞的增殖率明顯高于其他組，成骨標志物的沉積以及Ⅰ型膠原蛋白也均高于其他組［17］。該研究認為nHA的加入可以有效促進成骨細胞的增殖分化以及促進成骨。本研究的增殖率的實驗中，在第1天和第5天，實驗組的細胞增殖率并未顯示出與對照組有統(tǒng)計學差異，我們認為其原因可能是MG-63細胞在第1天粘附于生物膜上未進入高速的增殖期［18］，而在第5天未顯示出差異，可能是因為細胞的接觸抑制產(chǎn)生的影響［19］；在第3天時出現(xiàn)實驗組比對照組及空白組的增殖率都高，可能是因為nHA的加入，誘導了MG-63細胞的增殖［20-21］。此外，有研究將nHA加入聚醚酮支架，nHA的加入提高了支架材料的粗糙度及親水性能［22］，該復合支架能夠有效促進成骨細胞的粘附，增殖以及成骨標志物的表達，認為nHA的加入大大提高了材料的生物活性，提高支架的粗糙度和親水性能有利于細胞的粘附與增殖。本研究認為nHA的加入能夠提高膜材料的孔徑，有利于細胞的粘附及增殖［23］。

ALP的表達是被認為成骨細胞在體外分化成熟成骨細胞及礦化基質的重要標志［24-25］，有研究發(fā)現(xiàn)，以HA涂層制備的羥基磷灰石-聚酰胺66支架與成骨細胞共同培養(yǎng)，相較于未用HA涂層的支架，HA無論是在成骨分化的早期和晚期，都能夠提高成骨相關蛋白（COL1、RUNX2和OCN）的表達，提高了ALP的活性［26］。該結果認為在支架中加入HA可以促進成骨相關蛋白的表達，促進了成骨細胞的分化，這與本研究結果一致。實驗組及對照組的ALP表達在3個時間段內均高于空白組，表明SF和CS能引導MG-63的ALP表達［27-28］；而實驗組的ALP表達也是明顯高于對照組，可能是實驗組加入了HA的原因，HA是人體自然骨的組成部分，其具有一定的骨引導性，能夠促進成骨相關蛋白的表達，可以誘導MG-63細胞的ALP表達［29］。

綜上所述，SF/CS/nHA具有良好的生物相容性及具有一定的骨引導性，能夠誘導成骨細胞的粘附，增殖及促進其成骨。在后續(xù)研究中，我們將進行該生物膜的動物實驗，以期該生物膜能成為一種新型的生物膜材料。