葛根芩連湯發(fā)酵液對流感病毒FM1感染模型小鼠的治療作用

肖奕珂，許華沖，鄧力，陳孝銀

（暨南大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510632）

流行性感冒（influenza），簡稱流感，是由流感病毒引起的急性發(fā)熱性呼吸道傳染病，經(jīng)飛沫傳播，傳染范圍廣泛[1]。尋找流感病毒治療的更優(yōu)方案有重要的研究意義。既往研究表明，葛根芩連制劑能治療流感[2]，方中葛根、黃芩、黃連、甘草都具有抗病毒作用[3-5]。葛根芩連湯的主要有效成分是葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿[6]。據(jù)報道，微生物發(fā)酵可增加葛根芩連湯中葛根素、黃芩苷等黃酮類化合物的含量[7-9]。當(dāng)前研究已發(fā)現(xiàn)，部分黃酮類化合物具有抗病毒作用[10]?；诟鸶诉B湯含有抗病毒成分，而發(fā)酵能增加其抗病毒成分的文獻(xiàn)研究背景，本研究擬探討葛根芩連湯發(fā)酵液防治流感的理論基礎(chǔ)及葛根芩連湯發(fā)酵液對流感小鼠的治療作用及機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF 級雌性C57BL/J 小鼠32 只，體質(zhì)量（18±2）g，購置于廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（粵）2013-0002。飼養(yǎng)于暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)P2 實驗室，日光照12 h，溫度（22±2）℃，濕度50%。

1.2藥物及制備葛根芩連湯由葛根、黃芩、黃連、甘草組成，葛根、黃芩、黃連、甘草比例為8∶3∶3∶2[4，7，11]，各中藥材購于康美藥業(yè)股份有限公司。將上述中藥材煎煮去藥渣后，制備成含生藥量為1.0 g·mL-1的溶液，旋蒸，微生物發(fā)酵，制成葛根芩連湯發(fā)酵液[9，12]。磷酸奧司他韋顆粒，由宜昌東陽光長江藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：H20080763。

1.3主要試劑與儀器流感病毒鼠肺適應(yīng)株（FM1）由暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室提供，血凝效價1∶16。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）試劑盒（日本TaKaRa公司）；GAPDH抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）；Toll 樣受體7（TLR-7）多克隆抗體（美國Bioworld Technology 公司）。T100 梯度 PCR 儀、CFX96 touch 實時熒光定量PCR 儀、PowerPac Basic 電泳系統(tǒng)、Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、Chemidoc MP 全能型成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.4分組與模型構(gòu)建將32只小鼠按隨機數(shù)字表分為空白對照組、模型對照組、西藥治療組、中藥治療組，每組8只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除空白對照組外，其余各組小鼠均經(jīng)乙醚輕度麻醉后進(jìn)行FM1 流感病毒鼠肺適應(yīng)株滴鼻處理，50 μL/只，連續(xù)3 d，建立流感模型[13-14]。

1.5給藥方法參照人和動物間體表面積折算的等效劑量比值確定藥物劑量[15]。造模結(jié)束后，中藥治療組給予葛根芩連湯發(fā)酵液（生藥劑量為10 g·kg-1）灌胃，西藥治療組給予磷酸奧司他韋（劑量為22.75 mg·kg-1）灌胃，空白對照組及模型對照組給予等體積生理鹽水灌胃。共灌胃4 d，每天2次。

1.6觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 觀察小鼠肺大體形態(tài) 給藥結(jié)束后，脫頸處死，解剖取肺，觀察肺大體形態(tài)。

1.6.2 病毒血凝實驗 取肺組織，研磨勻漿，取25 μL上清，在微量反應(yīng)板上選好一排孔，按倍比稀釋法，從第1孔稀釋到第8孔，每孔加入1.2%雞紅細(xì)胞懸液25 μL，充分混勻，室溫靜置45 min，觀察反應(yīng)結(jié)果。

1.6.3 RT-PCR 檢測小鼠肺組織FM1 mRNA 表達(dá)水平 取小鼠肺組織，應(yīng)用TRIzol試劑盒提取組織總RNA，核酸蛋白定量分析儀測定波長為260 nm、280 nm的吸光度（OD，D）值，根據(jù)D（260）/D（280）值，判斷RNA 純度。將純度合格的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板，采用SYBR 法進(jìn)行PCR檢測。2-△△Ct法計算肺組織中FM1 mRNA 相對表達(dá)水平。PCR反應(yīng)條件：95 ℃5 s，60 ℃30 s，循環(huán)次數(shù)40。FM1 引物序列：上游，5'-GACCAATCCTG TCACCTCTGAC-3'；下游，5'-GGGCATTTGGAC AAACGTCTACG-3'。擴(kuò)增片段長度240 bp。GAPDH引物序列：上游，5'-TGATGACATCAAGAAGGT GGTGAAG-3'；下游，5'-TCCTTGGAGGCCATGT AGGCAT-3'。擴(kuò)增片段長度240 bp。

1.6.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測小鼠肺組織TLR-7 蛋白相對表達(dá)水平 取肺組織，研磨，離心，提取上清液，即組織總蛋白。二喹啉甲酸（BCA）法檢測蛋白濃度。制備上樣樣本進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），轉(zhuǎn)印，封閉，分別孵育一抗（TLR-7 按1∶1 000稀釋；GAPDH按1∶1 000稀釋）和二抗，化學(xué)發(fā)光成像，以Image J 軟件分析目標(biāo)帶的凈光密度值。

1.6.5 蘇木素—伊紅（HE）染色法觀察小鼠結(jié)腸組織病理情況 取3 ～4 mm結(jié)腸組織，40 g/L多聚甲醛固定，酒精脫水，透明，浸蠟，包埋，切片及貼片，染色，封片，顯微鏡下觀察。

1.7統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)性及方差齊性，多組比較采用單因素方差分析，否則采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠肺大體形態(tài)變化圖1 結(jié)果顯示：空白對照組小鼠肺組織呈淡粉色。模型對照組小鼠肺組織充血腫脹，呈暗紅色。中藥治療組、西藥治療組肺組織局部充血腫脹，較模型對照組減輕，色澤介于暗紅與淡粉之間。

圖1 各組小鼠肺大體形態(tài)變化Figure 1 Comparison of the macroscopic pathological features of lung in various groups

2.2各組小鼠肺組織FM1 mRNA表達(dá)水平比較呼吸道標(biāo)本核酸陽性作為流感確診的關(guān)鍵指標(biāo)[1，16]。圖2結(jié)果顯示：與空白對照組比較，模型對照組小鼠肺組織FM1 mRNA 表達(dá)水平增高（P＜ 0.05）。表明模型對照組小鼠肺組織病毒核酸高表達(dá)，因此確定模型構(gòu)建成功。治療后，與模型對照組比較，中藥治療組、西藥治療組小鼠肺組織FM1 mRNA 表達(dá)水平下降（P＜0.05），且中藥治療組小鼠肺組織FM1 mRNA 表達(dá)水平低于西藥治療組（P＜0.05）。表明葛根芩連湯發(fā)酵液能有效降低流感小鼠肺組織病毒核酸高表達(dá)，治療效果優(yōu)于奧司他韋。

圖2 各組小鼠肺組織FM1 mRNA表達(dá)水平比較Figure 2 Comparison of the expression level of FM1 mRNA in lung tissue of various groups

2.3各組小鼠肺流感病毒血凝效價比較陰性對照組紅細(xì)胞呈紐扣狀沉淀在底部，證明實驗無其他干擾因素。陽性對照，即病毒原液稀釋度1∶2 ～1∶16 引起血凝反應(yīng)，從1∶32 開始即不再發(fā)生血凝反應(yīng)，表明其血凝價為1∶16。表1結(jié)果顯示，模型對照組肺組織勻漿稀釋度為1∶2 ～1∶128 時引起血凝反應(yīng)，1∶256 開始不再反應(yīng)，表明其血凝價為1∶128。模型對照組病毒血凝價高于病毒感染原液，說明流感病毒株毒力經(jīng)鼠肺傳染后活性增強。西藥治療組病毒血凝價均在稀釋度1∶2 ～1∶8時引起血凝反應(yīng)，1∶16 開始不再反應(yīng)，表明其血凝價為1∶8。中藥治療組病毒血凝價均在1∶2 ～1∶16引起血凝反應(yīng)，1∶32 開始不再反應(yīng)，表明其血凝價為1∶16。表明葛根芩連湯發(fā)酵液治療可降低小鼠肺流感病毒血凝效價。

表1 各組小鼠肺流感病毒血凝效價比較Table 1 Comparison of the influenza virus hemagglutinin titer in various groups

2.4各組小鼠肺組織TLR-7蛋白相對表達(dá)水平比較圖3結(jié)果顯示：與空白對照組比較，模型對照組小鼠肺組織TLR-7 蛋白相對表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與模型對照組比較，中藥治療組、西藥治療組小鼠肺組織TLR-7 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；但與西藥治療組比較，中藥治療組小鼠肺組織TLR-7表達(dá)水平升高（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠肺組織TLR-7蛋白相對表達(dá)水平比較Figure 3 Comparison of the relative expression level of TLR-7 protein in lung tissue of various groups

2.5各組小鼠結(jié)腸組織病理變化比較圖4 結(jié)果顯示：空白對照組小鼠結(jié)腸組織單層柱狀上皮細(xì)胞排列緊密，大腸腺形態(tài)完好，黏膜層、黏膜下層、肌層清晰可見，紋理分明。與空白對照組比較，模型對照組小鼠結(jié)腸組織單層柱狀上皮細(xì)胞排列疏松，大腸腺形態(tài)萎縮；中藥治療組、西藥治療組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)與空白對照組相近。

圖4 各組小鼠結(jié)腸組織病理變化比較（HE染色，×100）Figure 4 Comparison of the pathological features in colon tissue of various groups（by HE staining，×100）

3 討論

微生物發(fā)酵技術(shù)在中國已有數(shù)千年的歷史，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中“湯液醪醴論”講述了古人利用微生物發(fā)酵將五谷轉(zhuǎn)化成為治病的醪醴[17]，唐朝已有文獻(xiàn)論述將中藥制成藥酒的方法及用途[12]。由《湯液醪醴論》可知：“古人釀五谷為酒，備邪氣時至，服之萬全?！蔽⑸锇l(fā)酵能延長保存時間，還可以改變藥物的性味，增添新的功效。研究葛根芩連湯發(fā)酵液對流感的治療作用有助于開發(fā)中藥新劑型，延長湯劑的保質(zhì)時間，降低防腐劑等添加劑的使用，具有實際應(yīng)用價值。與葛根芩連湯原液相比，發(fā)酵液中未出現(xiàn)新的次級代謝產(chǎn)物，生物堿含量穩(wěn)定，黃芩苷、小檗堿等異黃酮含量增加[9]，黃芩苷[18]、小檗堿[19]可抑制神經(jīng)氨酸酶活性?；诹啃шP(guān)系[20]，可以認(rèn)為酵母發(fā)酵能增加葛根芩連湯的抗病毒成分，增強治療作用。發(fā)酵使大分子多糖類成分減少，增加了小分子糖含量[21]。與大分子多糖不同，小分子糖不僅具有免疫調(diào)節(jié)功能，還能促進(jìn)雙歧桿菌生長，抑制大腸桿菌生長[22]。腸道菌群失調(diào)是流感病情加重的原因之一[23]。與大分子多糖相比，小分子糖類可能更有利于腸道菌群恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。本研究結(jié)果顯示，葛根芩連湯發(fā)酵液能有效降低流感小鼠肺組織病毒核酸的高表達(dá)，治療效果優(yōu)于奧司他韋。

天然免疫應(yīng)答是機體抵御微生物感染的第一道防線。Toll樣受體家族在機體天然免疫對病原體的識別方面發(fā)揮著非常重要的作用[24]。其中TLR-7可以識別病毒ssRNA，啟動MyD88 依賴的信號通路，激活核因子NF-κB，進(jìn)而引起白細(xì)胞介素8（IL-8）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等促炎癥因子和I 型干擾素的產(chǎn)生，介導(dǎo)機體抗病毒免疫應(yīng)答[25]。本研究結(jié)果顯示，葛根芩連湯發(fā)酵液可使流感小鼠肺組織TLR-7 表達(dá)下調(diào)，表明葛根芩連湯發(fā)酵液可能通過抑制TLR-7表達(dá)在流感治療中發(fā)揮抗炎作用。

流感為上呼吸道感染，病位在肺[1]，中醫(yī)認(rèn)為：“肺與大腸相表里，肺病可以治腸?！盵26]葛根芩連湯主治陽明里熱，病位在腸[27]。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型對照組小鼠結(jié)腸組織單層柱狀上皮細(xì)胞排列疏松，大腸腺形態(tài)萎縮。中藥治療組、西藥治療組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)的與空白對照組相近。保護(hù)小鼠腸道組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的完整可能是葛根芩連湯發(fā)酵液治療流感的原因之一。

綜上所述，葛根芩連湯發(fā)酵液對流感模型小鼠具有治療效果，可抑制肺組織病毒核酸表達(dá)，抑制肺組織TLR-7 蛋白表達(dá)，維持腸正常生理組織結(jié)構(gòu)形態(tài)穩(wěn)定。

本實驗仍存在以下不足：（1）尚未能探明葛根芩連湯發(fā)酵液治療流感的“肺與大腸相表里”的內(nèi)在機制；（2）尚未能探明葛根芩連湯發(fā)酵液治療流感小鼠的主要原因是其黃酮類成分的抗病毒作用，還是輔助免疫系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞達(dá)到清除病毒的治療效果。但可為后續(xù)研究指明研究方向。在后續(xù)研究中將探討葛根芩連湯發(fā)酵液對TLR-7 信號通路及其介導(dǎo)的細(xì)胞因子的影響，以進(jìn)一步闡明其抗肺炎病毒機制。