基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討三七對骨愈合的作用機(jī)制

吳文正，鄭曉輝，高怡加，歐陽崇志，黃敏玲，楊銳敏

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

在骨科研究領(lǐng)域中，怎樣促使骨愈合一直是一個難題[1]。影響骨愈合的因素很多，包括全身性因素、局部因素和治療因素。在骨修復(fù)領(lǐng)域，各學(xué)科包括組織學(xué)、生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物材料學(xué)等采取了一系列相關(guān)措施和方法來促進(jìn)骨愈合[2]，而中醫(yī)藥在促進(jìn)骨愈合方面具有明顯的優(yōu)勢[3]。三七是臨床治療骨傷的常用中藥，具有活血、止痛、止血、消腫等功效[4-5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，三七可顯著增加骨折骨痂的骨量和骨密度，促進(jìn)骨愈合[5]，其相關(guān)活性成分可改善血液流變性和骨折部位的血供，促進(jìn)成骨細(xì)胞形成、分化和礦化，從而有利于骨愈合[4，6-8]。但由于中藥具有成分多樣性及其對機(jī)體作用機(jī)制的復(fù)雜性，對于三七促進(jìn)骨愈合的作用機(jī)制尚未完全明確。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)構(gòu)建多層次網(wǎng)絡(luò)模型，從整體角度對中藥進(jìn)行研究，已成為一種科學(xué)解釋中藥有效性和科學(xué)性的新策略[9-10]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探討三七對骨愈合的作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步的實驗驗證提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1三七的化學(xué)成分及作用靶點的預(yù)測TCMSP（網(wǎng)址：http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）是一個整合了藥物代謝動力學(xué)、藥物化學(xué)和藥物—靶標(biāo)蛋白網(wǎng)絡(luò)—疾病網(wǎng)絡(luò)的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺[11]。TCMSP具有識別藥物靶點網(wǎng)絡(luò)和藥物疾病網(wǎng)絡(luò)的能力，這有助于揭示中草藥的作用機(jī)制，揭示中醫(yī)理論的本質(zhì)，開發(fā)新的以草藥為導(dǎo)向的藥物[12]。UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）是一個可以提供穩(wěn)定、全面的蛋白質(zhì)序列和功能注釋并可免費(fèi)訪問的資源中心[13]。本研究通過檢索TCMSP 獲得三七的化學(xué)成分，篩選出符合條件[口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%和類藥性（drug-likeness，DL）＞ 0.18][11]的候選化學(xué)成分及其對應(yīng)靶點，再借助UniProt 數(shù)據(jù)庫查詢靶點對應(yīng)基因名的簡稱。

1.2骨愈合相關(guān)靶點及其與藥物靶點交集的獲取以“bone healing”為檢索詞，在GeneCards（網(wǎng)址：https：//www.genecards.org）數(shù)據(jù)庫和OMIM（網(wǎng)址：https：//omim.org）數(shù)據(jù)庫中搜索骨愈合的相關(guān)靶點，并取其與“1.1”項所獲得的三七相關(guān)作用靶點的交集，提取整理三七—骨愈合交集靶點。

1.3“三七化學(xué)成分—作用靶點—骨愈合”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析利用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建化合物—靶點（基因）網(wǎng)絡(luò)，通過軟件中的“Network Analyzer”功能對三七化學(xué)成分和作用靶點間的度（Degree）值進(jìn)行分析。根據(jù)化學(xué)成分與靶點連接情況篩選出三七作用于骨愈合的關(guān)鍵化合物。

1.4蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及其核心靶點的篩選將“1.2”項中的三七—骨愈合交集靶點導(dǎo)入STRING 11.0在線數(shù)據(jù)庫（網(wǎng)址：https：//string-db.org），將研究物種設(shè)置為“Homo sapiens”，從而得到三七作用于骨愈合的PPI網(wǎng)絡(luò)。利用R語言軟件（版本3.6.1）對獲得的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析獲得關(guān)鍵靶點并作圖。

1.5基因本體論（GO）功能富集分析及基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析將三七—骨愈合交集基因?qū)隓AVID 6.8 數(shù)據(jù)庫（網(wǎng)址：https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp），輸入靶基因名稱列表，限定物種為“Homo sapiens”，將靶基因名修正為官方名稱（official gene symbol），設(shè)定閾值P＜0.05，進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，并用利用R 語言軟件（版本3.6.1）對其分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1三七化學(xué)成分及作用靶點的篩選結(jié)果從TCMSP 平臺中檢索三七的化學(xué)成分，并以O(shè)B ＞30%，DL ＞0.18 為條件，共篩選出化學(xué)成分8 個。再從TCMSP 平臺中檢索三七的作用靶點，根據(jù)選出的化學(xué)成分篩選出對應(yīng)的靶點，其中1個候選化學(xué)成分無作用靶點，共得到不重復(fù)的靶點89個。

2.2骨愈合相關(guān)靶點獲取及三七—骨愈合交集靶點的整理在GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫中檢索“bone healing”，共得到3 622個骨愈合的相關(guān)靶點基因，與“2.1”項中所獲三七作用靶點取交集后，獲得三七—骨愈合交集靶點70個。

2.3“三七—化學(xué)成分—作用靶點—骨愈合”網(wǎng)絡(luò)及分析結(jié)果通過Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建“三七—化學(xué)成分—作用靶點—骨愈合”網(wǎng)絡(luò)，見圖1?；瘜W(xué)成分中，Degree值最高者為槲皮素（quercetin），其 次 為 β- 谷 甾 醇（beta- sitosterol）、 豆 甾 醇（stigmasterol）、人參皂苷Rh2（ginsenoside rh2），食脂素（DFV）、十八碳二烯（mandenol）、鄰苯二甲酸二異辛酯（diop），其所對應(yīng)的作用靶點分別為64、11、9、4、2、2、1 個。其中，槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、人參皂苷Rh2 可能是三七發(fā)揮促進(jìn)骨愈合作用的關(guān)鍵化學(xué)成分。

圖1 “三七—化學(xué)成分—作用靶點—骨愈合”網(wǎng)絡(luò)Figure 1 “Radix Notoginseng-chemical constituents-targets-bone healing”network

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點的篩選將70 個三七—骨愈合交集靶點導(dǎo)入STRING 11.0在線數(shù)據(jù)庫行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，見圖2。圖中共包含70個節(jié)點（表示相關(guān)蛋白），602 條邊（表示蛋白與蛋白之間的相互作用）。發(fā)生蛋白相互作用的靶點有68 個（2 個靶點未發(fā)生蛋白相互作用）。將PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入R 語言軟件（版本3.6.1），根據(jù)Degree 值篩選出排名前30位的節(jié)點，見圖3。這些節(jié)點對應(yīng)的靶點可能是三七作用于骨愈合的關(guān)鍵靶點。

圖2 三七—骨愈合交集靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 PPI network diagram of intersection target protein between Radix Notoginseng and bone healing

圖3 Degree 值排名前30位的靶點Figure 3 Targets for the top 30 Degrees

圖4 三七—骨愈合交集基因GO功能富集分析結(jié)果Figure 4 GO functional enrichment analysis results of the intersection genes of Radix Notoginseng-bone healing

2.5 GO功能富集分析將70 個三七—骨愈合交集基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫，通過GO功能富集分析得到GO 條目284個（P＜ 0.05），其中207個生物過程（biological process，BP）條目，25 個細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目，52 個分子功能（molecular function，MF）條目，分別選取P值排名前20位作可視化展示，見圖4。其中：生物過程主要包括對雌二醇的反應(yīng)（response to estradiol）、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、DNA 模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（positive regulation of transcription，DNA-templated）、老化（aging）、缺氧的反應(yīng)（response to hypoxia）、凋亡過程負(fù)調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）、藥物反應(yīng)（response to drug）、對乙醇的反應(yīng)（response to ethanol）、凋亡過程（apoptotic process）等；細(xì)胞組成方面主要包括細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)（cytosol）、細(xì)胞外間隙（extracellular space）、核質(zhì)（nucleoplasm）、膜筏（membrane raft）、 細(xì) 胞 核（nucleus）、 細(xì) 胞 質(zhì)（cytoplasm）等；分子功能主要為酶結(jié)合（enzyme binding）、 相 同 的 蛋 白 結(jié) 合（identical protein binding）、 轉(zhuǎn) 錄 因 子 結(jié) 合（transcription factor binding）、蛋白結(jié)合（protein binding）、蛋白質(zhì)異二聚化活性（protein heterodimerization activity）等。

圖5 三七—骨愈合交集基因KEGG通路富集分析結(jié)果Figure 5 KEGG pathway enrichment analysis results of the intersection genes of Radix Notoginseng-bone healing

2.6 KEGG通路富集分析通過對70個三七—骨愈合交集靶點的KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，三七作用于骨愈合主要涉及66條通路（P＜0.05）。篩選出其中富集基因數(shù)居前30 位的通路，并作可視化展示，見圖5。其中主要涉及腫瘤、乙型肝炎、人類T細(xì)胞白血病病毒感染、甲型流感、軍團(tuán)菌病、結(jié)核病、弓形蟲病、病毒性心肌炎等人類疾病通路，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶3（PI3K-Akt）信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、鈣信號通路、Ras 信號通路、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路等環(huán)境信息處理通路，甲狀腺激素信號通路、催乳激素信號通路等有機(jī)系統(tǒng)通路，細(xì)胞局部粘附、p53信號通路、細(xì)胞凋亡等細(xì)胞過程通路。由此可見，三七可以通過上述多條信號通路作用于骨愈合。

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫和軟件，探討了三七對骨愈合的作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)三七主要作用于骨愈合的的主要化學(xué)成分為槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、人參皂苷Rh2等。既往研究表明，槲皮素能夠通過上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）2 和Smad4基因的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨分化[14]；β-谷甾醇可通過提高成骨細(xì)胞護(hù)骨素/破骨細(xì)胞分化因子（OPG/ODF）的比值從而促進(jìn)和加強(qiáng)成骨作用[15]；人參皂苷Rh2 可能通過下調(diào)NFATc1、c-Fos從而抑制破骨細(xì)胞的分化[16]；而目前關(guān)于豆甾醇與骨愈合之間的研究較少，這為進(jìn)一步的實驗探討提供了新方向。

通過構(gòu)建PPI并分析出三七作用于骨愈合的關(guān)鍵靶點主要為IL6、CASP3、EGFR、VEGFA、MYC、ESR1 等，其對應(yīng)的Degree 值分別為49、45、44、43、41、40。這表明三七對骨愈合的作用機(jī)制呈多成分、多靶點的特點。

本研究對三七—骨愈合交集靶點進(jìn)行KEGG富集通路分析發(fā)現(xiàn)30 條通路與三七作用于骨愈合顯著相關(guān)。所篩選出來的通路中，富集基因數(shù)最多的為人類疾病通路，但人類疾病相關(guān)通路多較為復(fù)雜，常包括多個下游通路，如腫瘤信號通路的下游通路包括PI3K-Akt 信號通路、HIF-1 信號通路、MAPK 信號通路、鈣信號通路、VEGF 信號通路、p53信號通路、Wnt信號通路、Notch信號通路等，乙型肝炎通路的下游通路包括PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、p53 信號通路、Ras 信號通路等。所篩選的環(huán)境信息處理通路中，PI3KAkt信號通路是十分重要的有絲分裂信號通路，在細(xì)胞生長、存活、增殖和運(yùn)動各種細(xì)胞過程中發(fā)揮著基本作用[17]。已有研究報告了PI3K信號的關(guān)鍵調(diào)節(jié)功能及其在骨形成和重塑中的下游目標(biāo)[18-19]。也有研究發(fā)現(xiàn)，bFGF 可通過激活PI3K/Akt 信號通路促進(jìn)OPG、Runx2、p-Akt 和BMP2 蛋白的表達(dá)以及鈦表面成骨細(xì)胞的增殖、分化和成骨[20]。骨是一種高度血管化的組織[21]，骨修復(fù)和再生的進(jìn)展與血管生長密切相關(guān)。低氧誘導(dǎo)因子（HIF）是在血管生成、紅細(xì)胞生成、能量代謝和細(xì)胞命運(yùn)決定中發(fā)揮重要作用的氧依賴性轉(zhuǎn)錄激活因子。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 及其靶基因是血管生成—成骨偶聯(lián)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[22]。軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞通過HIF信號通路感知降低的氧張力，在骨修復(fù)和再生過程中傳遞與血管生成和成骨基因程序相關(guān)的信號[23]。此外，Wnt 信號通路、Notch 信號通路、MAPK 信號通路、鈣信號通路、VEGF 信號通路等也均為參與骨再生的重要信號通路[24-25]。所篩選的有機(jī)系統(tǒng)通路中，已有研究證明甲狀腺激素信號通路在骨骼生長調(diào)控中起著關(guān)鍵的作用，甲狀腺激素通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等其他類型骨細(xì)胞和調(diào)控胰島素樣生長因子1（IGF-1）、Wnt、甲狀旁腺相關(guān)蛋白（PTHrP）和成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）等關(guān)鍵的生長因子信號通路來調(diào)節(jié)骨的生長[26-27]。催乳素在一定濃度范圍（0.01 ～ 10.0 μg/mL）內(nèi)抑制體外培養(yǎng)奶牛成骨細(xì)胞的增殖和分化[28]。本研究所篩選的細(xì)胞過程通路中，細(xì)胞局部粘附對于細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、基因表達(dá)調(diào)節(jié)和細(xì)胞存活等生物過程起重要作用，如黏著斑激酶（FAK）的激活需要通過細(xì)胞局部粘附通路，其對于BMP 發(fā)揮出刺激成骨細(xì)胞標(biāo)志物的作用而言是必不可少的[29]。p53 信號通路與骨量、骨質(zhì)疏松、骨折愈合密切相關(guān)，在骨重塑中發(fā)揮著重要作用[30]。研究發(fā)現(xiàn)，Ccnb2 和Rrm2 調(diào)節(jié)因子可能是通過激活p53 信號通路從而抑制骨質(zhì)疏松小鼠的骨愈合[31-32]。

綜上所述，三七對骨愈合的作用機(jī)制呈多成分、多靶點、多通路的特點，主要通過腫瘤疾病通路、PI3K-Akt 信號通路、甲狀腺激素信號通路、細(xì)胞局部粘附等多方面的途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)骨愈合的作用，這為進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制指明了方向，有待動物實驗加以驗證。