正交法探究幾種因素對(duì)啤酒酵母發(fā)酵PYF現(xiàn)象的影響

□ 張朝武 德樂(lè)食品飲品配料（上海）有限公司研發(fā)中心

啤酒酵母發(fā)酵 PYF（Premature Yeast Flocculation）現(xiàn)象，即啤酒酵母在發(fā)酵過(guò)程中提前絮凝沉降使啤酒發(fā)酵液中的酵母數(shù)減少，造成發(fā)酵液降糖速度降低、發(fā)酵周期延長(zhǎng)、啤酒中雙乙酰和乙醛等風(fēng)味物質(zhì)含量偏高，進(jìn)而導(dǎo)致啤酒的發(fā)酵過(guò)程失敗及可飲性下降。因此，啤酒酵母發(fā)酵PYF現(xiàn)象是啤酒釀造過(guò)程中一個(gè)非常關(guān)鍵的技術(shù)指標(biāo)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外諸多啤酒專家和學(xué)者研究并報(bào)道了啤酒酵母發(fā)酵PYF現(xiàn)象的進(jìn)展和成果，但較為偏重于理論層面的研究，對(duì)啤酒工業(yè)實(shí)際生產(chǎn)的指導(dǎo)意義有限。

目前，已報(bào)道的影響啤酒酵母發(fā)酵PYF現(xiàn)象的主要因素包括制麥工藝、微生物代謝產(chǎn)物、酵母菌種特性、麥芽汁的營(yíng)養(yǎng)成分組成、發(fā)酵工藝參數(shù)等。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)探究了麥芽表面的霉菌數(shù)量、浸麥二氧化碳含量、麥汁煮沸鋅離子添加量、浸麥溫度這4個(gè)因素對(duì)啤酒酵母發(fā)酵PYF現(xiàn)象的影響，同時(shí)使用正交實(shí)驗(yàn)探究最佳的因素組合與各個(gè)因素的影響大小次序。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備、原材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

臺(tái)秤、EBC標(biāo)準(zhǔn)麥芽粉碎機(jī)、啤酒糖化儀、定量快速濾紙、燒瓶、電磁爐、恒溫水浴搖床、250mL的Schott玻璃瓶若干、移液槍、電子顯微鏡、血球細(xì)胞計(jì)數(shù)板、蓋玻片、酵母計(jì)數(shù)器、蝸旋振蕩器。

1.2 實(shí)驗(yàn)原料

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求的試驗(yàn)啤酒麥芽、城市自來(lái)水、斜面酵母菌種、無(wú)菌蒸餾水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 啤酒麥芽的粉碎

按實(shí)驗(yàn)設(shè)定的要求將不同的啤酒麥芽用EBC標(biāo)準(zhǔn)啤酒麥芽粉碎機(jī)粉碎，取5個(gè)糖化杯，每個(gè)糖化杯用實(shí)驗(yàn)室臺(tái)秤準(zhǔn)確稱量100g麥芽粉。

1.3.2 啤酒協(xié)定麥汁的制備

設(shè)定糖化儀的溫度曲線為：48℃休止40分鐘，63℃休止30分鐘，72℃休止30分鐘，85℃休止5分鐘。將45℃的自來(lái)水分別投入5個(gè)裝有麥芽粉的糖化杯中，每個(gè)糖化杯加入300g水，然后攪拌均勻，放入糖化儀中進(jìn)行糖化。糖化結(jié)束后，用定量快速濾紙過(guò)濾糖化的醪液，得到澄清的麥芽汁，之后向麥芽汁中加入少量自來(lái)水將麥芽汁的Plato糖度調(diào)整為11°。取250mL的Schott玻璃瓶若干，準(zhǔn)確稱量Plato糖度為11°的麥芽汁200g分別加入Schott瓶中，擰緊瓶蓋，放入沸水中殺菌60分鐘后取出放入15℃的水浴鍋中保溫備用。

1.3.3 酵母的接種

從冰箱冷藏室中取出試管斜面培養(yǎng)的啤酒酵母，用接種針取一定數(shù)量的酵母放入50mL無(wú)菌塑料試管中，加入50mL無(wú)菌蒸餾水后蓋上試管蓋子，在蝸旋振蕩器上振蕩3分鐘，酵母在無(wú)菌蒸餾水中均勻分散后使用5mL移液槍迅速移取5mL酵母水溶液到上述裝有15℃麥芽汁的Schott玻璃瓶中并擰緊瓶蓋。

1.3.4 麥汁的充氧和發(fā)酵

將上述Schott玻璃瓶雙臂交叉搖晃振蕩60次，且每20次打開(kāi)瓶蓋充氧5秒，然后擰緊瓶蓋繼續(xù)搖晃振蕩。之后，將充氧和搖勻的發(fā)酵液放到15℃恒溫水浴搖床中發(fā)酵。

1.3.5 酵母的計(jì)數(shù)和PYF數(shù)值計(jì)算

發(fā)酵48小時(shí)后取出玻璃瓶，打開(kāi)瓶蓋，用移液槍移取少量發(fā)酵液到血球計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，然后用電子顯微鏡讀出酵母數(shù)。此時(shí)，將實(shí)驗(yàn)樣酵母數(shù)除以標(biāo)準(zhǔn)樣酵母數(shù)即為實(shí)驗(yàn)樣的PYF數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 啤酒酵母發(fā)酵PYF現(xiàn)象的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 啤酒麥芽表面的霉菌數(shù)量對(duì)于PYF現(xiàn)象的影響

麥芽表面的霉菌會(huì)在特殊的應(yīng)激環(huán)境下分泌霉菌毒素等初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物會(huì)影響啤酒酵母發(fā)酵PYF現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)室做了5組試驗(yàn)，得到如下數(shù)據(jù)：霉菌為3200個(gè)/g時(shí)，PYF為67%；霉菌為4400個(gè)/g時(shí)，PYF為70%；霉菌為7100個(gè)/g時(shí)，PYF為71%；霉菌為25000個(gè)/g時(shí)，PYF為97%；霉菌為3900個(gè)/g時(shí)，PYF為92%。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，在霉菌菌落數(shù)為25000個(gè)/g時(shí)，得到的PYF數(shù)據(jù)最大峰值為97%，是較為理想的數(shù)據(jù)。因此，選擇霉菌數(shù)量為20000個(gè)/g、25000個(gè)/g、30000個(gè)/g進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.1.2 制麥時(shí)浸麥溫度對(duì)于PYF現(xiàn)象的影響

制麥過(guò)程中，當(dāng)大麥發(fā)芽時(shí)如外界環(huán)境發(fā)生變化會(huì)使種子產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而生成一些特殊的復(fù)雜成分，從而影響后期的酵母發(fā)酵過(guò)程。使用實(shí)驗(yàn)室微型制麥機(jī)，通過(guò)調(diào)整浸麥溫度得到不同的PYF數(shù)據(jù)：浸麥溫度為7℃時(shí)，PYF為91%；浸麥溫度為10℃時(shí)，PYF為100%；浸麥溫度為15℃時(shí)，PYF為97%；浸麥溫度為20℃時(shí)，PYF為94%；浸麥溫度為25℃時(shí)，PYF為83%。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，在浸麥溫度為10℃時(shí)，酵母發(fā)酵PYF為最高值100%，故選擇浸麥溫度8℃、10℃、12℃進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.1.3 制麥時(shí)浸麥二氧化碳濃度對(duì)于PYF現(xiàn)象的影響

在實(shí)驗(yàn)室微型制麥車間中，通過(guò)測(cè)定干法浸麥期間開(kāi)啟或關(guān)閉鼓風(fēng)機(jī)檢測(cè)了浸麥層的二氧化碳含量，試驗(yàn)了不同干法浸麥時(shí)二氧化碳含量對(duì)于酵母發(fā)酵PYF現(xiàn)象的影響，試驗(yàn)數(shù)據(jù)為：二氧化碳含量為2000ppb時(shí)，PYF為103%；二氧化碳含量為5000ppb時(shí)，PYF為100%；二氧化碳含量為10000ppb時(shí)，PYF為98%；二氧化碳含量為20000ppb時(shí)，PYF為95%；二氧化碳含量為25000ppb時(shí)，PYF為92%。由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，隨著二氧化碳濃度的升高，PYF值越來(lái)越小，因此較低的二氧化碳濃度會(huì)減弱PYF現(xiàn)象，故選擇二氧化碳含量為1500ppb、2000ppb、2500ppb進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.1.4 啤酒麥汁煮沸時(shí)鋅離子添加量對(duì)于PYF現(xiàn)象的影響

在啤酒糖化麥汁煮沸結(jié)束前5分鐘加入酵母營(yíng)養(yǎng)硫酸鋅—適量添加鋅離子對(duì)于酵母的發(fā)酵有益，但鋅離子過(guò)多會(huì)導(dǎo)致酵母發(fā)酵機(jī)能減弱。本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室協(xié)定麥汁中添加硫酸鋅0.25ppm、0.75ppm、1.25ppm、1.75ppm、2ppm，對(duì)應(yīng)的PYF數(shù)據(jù)為83%、98%、97%、78%、65%。由數(shù)據(jù)可知，硫酸鋅添加量為0.75ppm時(shí)得到的PYF數(shù)據(jù)比較理想，故選擇硫酸鋅添加量為0.50ppm、0.75ppm、1.00ppm進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表1 四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)

2.2 啤酒酵母發(fā)酵PYF現(xiàn)象的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表，將正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最優(yōu)發(fā)酵組合與得分最高的一組進(jìn)行最佳條件驗(yàn)證。

表2 設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表

3 結(jié)論

根據(jù)目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于啤酒酵母發(fā)酵PYF現(xiàn)象的研究表明，其影響因素眾多，但并沒(méi)有研究能夠明確表明影響因素的主次順序。本實(shí)驗(yàn)選取4個(gè)單因素—浸麥層二氧化碳含量、麥芽表面的霉菌數(shù)量、浸麥溫度與硫酸鋅添加量進(jìn)行探究，雖然它們未必是影響啤酒酵母發(fā)酵PYF現(xiàn)象的最主要或關(guān)鍵因素，但是通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)PYF的影響顯著，因此可以用這4個(gè)因素來(lái)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于啤酒酵母發(fā)酵PYF現(xiàn)象的影響程度的因素順序?yàn)椋憾趸己浚久咕鷶?shù)量＞浸麥溫度＞硫酸鋅添加量。正交實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)化的結(jié)果和組合為：霉菌數(shù)量25000個(gè)/g、浸麥溫度10℃、二氧化碳含量2000ppb、硫酸鋅添加量0.50ppm，對(duì)應(yīng)PYF值為105%。

本實(shí)驗(yàn)采用的PYF檢測(cè)分析方法是根據(jù)實(shí)際啤酒生產(chǎn)工藝開(kāi)發(fā)的實(shí)驗(yàn)室方法，通過(guò)使用相同的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和安排同一操作人員，可以在很大程度上消除試驗(yàn)數(shù)據(jù)的系統(tǒng)誤差，故試驗(yàn)數(shù)據(jù)總體可信度較高。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究表明，在實(shí)際的啤酒生產(chǎn)過(guò)程中，控制浸麥時(shí)二氧化碳含量和麥芽表面的霉菌數(shù)量非常重要，其可以在一定程度上改善啤酒酵母發(fā)酵PYF現(xiàn)象。