海鱸魚(yú)糜加工及凝膠形成過(guò)程中蛋白質(zhì)的變化機(jī)理

劉芳芳,林婉玲,李來(lái)好,吳燕燕,楊少玲,黃 卉,楊賢慶,林 織

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510300;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;3.廣東順欣海洋漁業(yè)集團(tuán)有限公司,廣東 陽(yáng)江 529800)

魚(yú)糜是指己經(jīng)去皮的魚(yú)肉經(jīng)過(guò)漂洗、脫水、精濾后得到的蛋白質(zhì)濃縮物,有“濃縮的肌原纖維蛋白”之稱(chēng)[1]。魚(yú)糜制品是以冷凍魚(yú)糜或新鮮魚(yú)糜為原料,添加輔料擂潰成魚(yú)漿,然后成型、加熱,制成具有彈性的凝膠體[2]。蛋白質(zhì)凝膠是影響?hù)~(yú)糜制品品質(zhì)的關(guān)鍵,其構(gòu)象變化決定著凝膠特性。目前,熱誘導(dǎo)魚(yú)糜形成凝膠是較為普遍的凝膠形成方式。熱誘導(dǎo)蛋白質(zhì)凝膠是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程[3],加熱可以改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),使α-螺旋結(jié)構(gòu)部分向β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化[4-5],同時(shí)也可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)性質(zhì)及組成發(fā)生變化[6],如使蛋白質(zhì)溶解度降低等[7]。漂洗、斬拌等加工工藝對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象以及蛋白質(zhì)之間的化學(xué)作用力有一定影響,漂洗可以使蛋白質(zhì)溶解度以及巰基含量顯著降低[8],蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊含量減少[9]。但是,目前研究主要集中在漂洗和斬拌工藝對(duì)蛋白質(zhì)組成、凝膠持水性、凝膠強(qiáng)度和質(zhì)構(gòu)特性等的影響[10-11],關(guān)于魚(yú)糜加工及凝膠形成過(guò)程中蛋白質(zhì)間化學(xué)作用力對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響卻鮮見(jiàn)報(bào)道。漂洗、斬拌等工藝對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象、維持蛋白構(gòu)象的化學(xué)作用力的影響以及他們之間相互變化關(guān)系鮮見(jiàn)研究,另外漂洗和斬拌對(duì)魚(yú)糜微觀結(jié)構(gòu)的影響也鮮見(jiàn)報(bào)道。因此,研究魚(yú)糜加工工藝及加熱過(guò)程中蛋白質(zhì)特性的變化,對(duì)揭示魚(yú)糜凝膠形成機(jī)理具有重要的意義。

海水魚(yú)因含有較高的鹽溶蛋白而具有較好的凝膠特性,海鱸魚(yú)(Perca fluviatilis)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一,2017年全國(guó)海水養(yǎng)殖海鱸魚(yú)產(chǎn)量為15.66萬(wàn) t,比2016年增長(zhǎng)13.56%,年產(chǎn)量逐年提升。但隨著海鱸魚(yú)產(chǎn)量增大及壓塘問(wèn)題的產(chǎn)生,對(duì)海鱸魚(yú)加工品進(jìn)行多樣化開(kāi)發(fā)己經(jīng)迫在眉睫。海鱸魚(yú)具有肉質(zhì)潔白和骨刺較少的特點(diǎn),并且富含蛋白質(zhì)及人體必需氨基酸[12],很適合作為開(kāi)發(fā)魚(yú)糜產(chǎn)品的原料,生產(chǎn)海鱸魚(yú)糜等產(chǎn)品也是海鱸魚(yú)產(chǎn)量快速增長(zhǎng)的需要。目前關(guān)于海鱸魚(yú)糜的研究集中在高壓處理魚(yú)糜對(duì)凝膠強(qiáng)度的影響[13]、外援添加物[14]對(duì)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的影響以及混合魚(yú)糜[15]的研究,更傾向于工藝的研究,而關(guān)于海鱸魚(yú)糜凝膠機(jī)理的研究報(bào)道較少。本研究以海鱸魚(yú)為原料,研究其魚(yú)糜加工及凝膠形成過(guò)程中的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)-可溶性肽及蛋白質(zhì)間化學(xué)作用力等特性的變化,揭示海鱸魚(yú)糜加工及凝膠形成過(guò)程中蛋白質(zhì)變化機(jī)理,為海鱸魚(yú)糜的開(kāi)發(fā)應(yīng)用和海鱸魚(yú)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海鱸魚(yú)購(gòu)自廣州市黃沙水產(chǎn)市場(chǎng),平均體質(zhì)量2.5 kg,購(gòu)買(mǎi)后1 h內(nèi)運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室,立即宰殺制作魚(yú)糜,本實(shí)驗(yàn)制作魚(yú)糜所用海鱸魚(yú)均屬同一批魚(yú)。

食鹽、白砂糖(食品級(jí)) 廣州海珠區(qū)客村華潤(rùn)萬(wàn)家超市;氫氧化鈉、尿素、氯化鈉、TCA(均為分析純)廣州領(lǐng)馭生物科技有限公司;BeyoColorTM彩色預(yù)染蛋白 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;微量總巰基測(cè)試盒 南京建成生物工程有限公司;三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris)(分析純)美國(guó)Sigma公司;β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)(電泳級(jí)) 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

絞肉機(jī) 廣東省佛山市順德區(qū)陳村鎮(zhèn)恒基隆五金機(jī)械廠;打漿機(jī) 湖南省長(zhǎng)沙固利食品機(jī)械有限公司;IKA-T25組織勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司;HH-4快速恒溫?cái)?shù)顯水浴箱 常州澳華儀器公司;Sunrise-basic吸光酶標(biāo)儀 德國(guó)Tecan公司;Alpha1-4冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司;IRAffinity-1傅里葉紅外光譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 魚(yú)糜凝膠制備工藝

原料處理→采肉→漂洗(水洗1 次、0.2%鹽洗1 次,每次4 min,肉液比1∶4(g/mL))→擠壓脫水(保證含水量低于80%)→斬拌(空斬5 min后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%食鹽和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%白砂糖繼續(xù)斬拌10 min,斬拌溫度在4～10 ℃)→灌腸→低溫加熱(40 ℃加熱30 min形成凝膠化魚(yú)糜)→高溫加熱(將低溫加熱形成的凝膠化魚(yú)糜,經(jīng)過(guò)90 ℃加熱30 min后形成魚(yú)糜凝膠)。

1.3.2 pH值的測(cè)定

參考GB 5009.237—2016《食品pH值的測(cè)定》[16]。

1.3.3 水分含量的測(cè)定

參考GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》[17]。

1.3.4 化學(xué)作用力測(cè)定

參照Tan等[18]方法稍作修改。稱(chēng)取1 g樣品加10 mL A1提取液(0.6 mol/L NaCl),在5 000 r/min勻漿2 min,于4 ℃放置1 h,并在4 ℃、18 600 r/min離心25 min,上清液于4 ℃保存。上述離心所得沉淀加10 mL A2提取液(1.5 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合液),5 000 r/min勻漿2 min,于4 ℃放置1 h,4 ℃、18 600 r/min離心25 min,上清液4 ℃保存。將上述離心沉淀加10 mL A3提取液(8 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合液),在5 000 r/min勻漿2 min,于4 ℃層放置1 h,4 ℃、18 600 r/min離心25 min,上清液4 ℃保存,重復(fù)此步驟,并將2 次離心得到的上清液合并,4 ℃保存。繼續(xù)向沉淀加10 mL A4提取液(0.5 mol/L β-巰基乙醇、0.6 mol/L NaCl和8 mol/L尿素的混合液,pH 7),在5 000 r/min勻漿2 min,4 ℃放置1 h,4 ℃、18 600 r/min離心,上清液4 ℃保存。上述各步離心后所得上清液分別加入等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% TCA,3 950 r/min離心15 min,棄上清液,向沉淀中加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液于4 ℃放置,采用雙縮脲法測(cè)定其蛋白質(zhì)的含量。離子鍵、氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵的貢獻(xiàn)分別以溶解于A1、A2、A3、A4蛋白質(zhì)的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。

1.3.5 蛋白質(zhì)溶解度測(cè)定

參考劉海梅[19]方法,將1 g魚(yú)糜樣品溶解于20 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(含0.01 mg/mL SDS,8 mol/L尿素和0.02 mg/mL β-巰基乙醇,pH 8.0)中,均質(zhì),混合液100 ℃加熱2 min后,于室溫?cái)嚢? h,然后10 000 r/min離心30 min后取上清液10 mL,添加0.5 mg/mL冷TCA至終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL,混合液于4 ℃放置18 h,10 000 r/min離心3 min,沉淀物用10% TCA沖洗并溶解于0.5 mol/L NaOH溶液中。蛋白質(zhì)含量用雙縮脲法測(cè)定,溶解度表示為樣品在溶劑中測(cè)得的蛋白質(zhì)總量占總蛋白(凝膠直接溶解于0.5 mol/L NaOH溶液測(cè)得)的百分比。

1.3.6 總巰基含量測(cè)定

參照南京建成公司總巰基含量測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.7 TCA-可溶性肽測(cè)定

參考Benjakul等[20]方法并稍作修改。取2 g制備好的魚(yú)糜樣品至18 mL提前預(yù)冷的5% TCA溶液中,11 000 r/min均質(zhì)2 min,4 ℃靜置1 h,置于冷凍離心機(jī)中10 000 r/min離心15 min。根據(jù)雙縮脲法測(cè)定上清液中的TCA-可溶性肽含量,以樣品中Tyr物質(zhì)的量計(jì)算,結(jié)果用μmol/g表示。

1.3.8 紅外光譜法測(cè)定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

參照胡熠等[21]方法,將樣品冷凍干燥,取約2 mg干粉和200 mg KBr在研缽中充分研磨后取適量壓片,壓片完成后,用傅里葉紅外光譜儀在400～4 000 cm-1的波數(shù)范圍進(jìn)行全波段掃描測(cè)定吸光度,確定魚(yú)糜加工及凝膠形成過(guò)程。

1.3.9 電鏡掃描

將樣品切成小塊,用2.5%戊二醛固定液浸泡24 h以上,再用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.2)浸泡清洗20 min,重復(fù)4 次。依次用30%、50%、70%、90%、100%乙醇脫水15 min,最后用叔丁醇浸泡,每次15 min,重復(fù)3 次。冷凍干燥后鍍金,最后進(jìn)行電鏡掃描觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值及水分含量的變化

魚(yú)肉pH值對(duì)魚(yú)糜凝膠性能有顯著的影響。pH值低于6.3時(shí),會(huì)阻礙肌球蛋白三磷酸腺苷酶對(duì)肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的結(jié)合;高于8.0時(shí),蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力會(huì)增強(qiáng),影響凝膠作用;pH 6.5～7.5有利于魚(yú)糜凝膠的形成,超過(guò)這個(gè)范圍時(shí)則容易造成蛋白質(zhì)變性[22]。本研究的海鱸魚(yú)在魚(yú)糜加工及凝膠形成的過(guò)程中,pH值范圍為6.39～6.77(表1),原料pH值略低于最適范圍,但經(jīng)過(guò)漂洗,魚(yú)糜pH值顯著增大。研究表明,清水漂洗可以不同程度地提高魚(yú)肉的pH值,鹽洗可使魚(yú)肉pH值接近中性[23]。經(jīng)過(guò)斬拌、加熱形成凝膠后,pH值減小,這與魚(yú)肉自身營(yíng)養(yǎng)組成具有一定的關(guān)系。在斬拌過(guò)程中,脂肪酸釋放導(dǎo)致pH值減小,但均在形成凝膠的最適pH值范圍內(nèi)。凝膠化魚(yú)糜與斬拌魚(yú)糜pH值差異不顯著(P＞0.05),而魚(yú)糜凝膠相比于凝膠化魚(yú)糜,pH值顯著增大(P＜0.05),這主要由于隨著加熱溫度的升高,酸性基團(tuán)特別是羧基減少,形成酯結(jié)合的側(cè)鏈(R—CO—O—R’)[24],pH值增大;另外高溫加熱造成pH值增大與蛋白質(zhì)變性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化、游離氨基增多也有一定的關(guān)系。

水作為魚(yú)糜中含量最高的成分,在魚(yú)糜凝膠形成過(guò)程中起著重要的作用。海鱸魚(yú)糜加工及凝膠過(guò)程中含水量的變化如表1所示。海鱸魚(yú)肉含水量為75.16%,經(jīng)漂洗后,魚(yú)糜的含水量上升至79.32%,主要是由于漂洗后魚(yú)肉蛋白吸水膨脹。由于在斬拌時(shí)加入食鹽和白砂糖,斬拌后魚(yú)糜含水量顯著降低(P＜0.05)。后期經(jīng)過(guò)40 ℃和90 ℃加熱形成凝膠的過(guò)程中,魚(yú)糜含水量變化不顯著(P＞0.05),但比斬拌魚(yú)糜略高。魚(yú)糜在凝膠形成過(guò)程中,蛋白質(zhì)變性聚集形成空間三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),能夠捕獲更多的水分[25]。在魚(yú)糜加工過(guò)程中,水分狀態(tài)不斷發(fā)生著變化,并且不易流動(dòng)水與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)有一定的相關(guān)性,而蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要依靠蛋白質(zhì)間化學(xué)作用力維持,因此,進(jìn)一步研究魚(yú)糜加工及凝膠形成過(guò)程中蛋白質(zhì)間化學(xué)作用力的變化有利于進(jìn)一步揭示魚(yú)糜加工過(guò)程中蛋白質(zhì)的變化機(jī)理。

表1 魚(yú)糜加工及凝膠過(guò)程中pH值和含水量的變化Table 1 Changes in pH and water content during surimi processing and gelation

2.2 化學(xué)作用力的變化

在魚(yú)糜凝膠形成過(guò)程中,蛋白質(zhì)變性聚合形成空間三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。由圖1可知,離子鍵和氫鍵在整個(gè)過(guò)程中呈下降趨勢(shì),說(shuō)明離子鍵和氫鍵是主要維持蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu),而不是維持凝膠三維網(wǎng)絡(luò)的主要作用力。在魚(yú)糜凝膠形成過(guò)程中,首先需要鹽離子打破離子鍵,分散蛋白質(zhì),后經(jīng)加熱使得蛋白質(zhì)變性聚集。由圖1可知,相比于原料而言,魚(yú)糜經(jīng)過(guò)漂洗后離子鍵含量增大,斬拌后又減小,經(jīng)過(guò)加熱加工,離子鍵含量顯著減小(P＜0.05);氫鍵主要維持蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu),與蛋白質(zhì)凝膠化、茹彈性有一定的關(guān)系,氫鍵在蛋白質(zhì)受熱變性時(shí)發(fā)生斷裂,在魚(yú)糜凝膠冷卻以后會(huì)重新形成,起到穩(wěn)定結(jié)合水、促使凝膠變硬的作用[26]。

疏水相互作用和二硫鍵在整個(gè)過(guò)程中呈上升趨勢(shì)。在凝膠形成過(guò)程中,蛋白質(zhì)變性并有序聚集形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),并且依靠離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵等化學(xué)作用力達(dá)到平衡,其中疏水相互作用和二硫鍵發(fā)揮著主要的作用。疏水相互作用主要是蛋白質(zhì)受熱發(fā)生變性,疏水基團(tuán)暴露,增強(qiáng)了相鄰分子非極性基團(tuán)的相互作用,發(fā)生聚集形成凝膠,對(duì)于未受熱的蛋白質(zhì),這些基團(tuán)被包埋在α-螺旋結(jié)構(gòu)中。如圖1所示,經(jīng)過(guò)漂洗,海鱸魚(yú)糜的疏水相互作用增加31%,這主要是因?yàn)槠磿?huì)引起蛋白質(zhì)的部分氧化,而蛋白質(zhì)氧化會(huì)使蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水結(jié)合被打破,疏水基團(tuán)暴露,表面疏水性增加[27];斬拌后,疏水相互作用相比漂洗過(guò)程增加17%;40 ℃加熱,對(duì)疏水相互作用影響相對(duì)較小;90 ℃加熱形成魚(yú)糜凝膠后,疏水相互作用顯著增大(P＜0.05)。疏水相互作用的形成主要是依靠加熱,有研究表明,魚(yú)肉在60 ℃時(shí)疏水相互作用達(dá)到最大,并且由于魚(yú)種的不同,疏水相互作用最適形成溫度也有所差異[28]。因此,在本實(shí)驗(yàn)中,40 ℃凝膠化魚(yú)糜疏水相互作用顯著小于90 ℃加熱后形成的魚(yú)糜凝膠(P＜0.05)。

蛋白質(zhì)的聚集與二硫鍵的生成緊密相關(guān)[29],形成于魚(yú)糜加工的各個(gè)階段。加熱是熱誘導(dǎo)凝膠形成過(guò)程中巰基氧化形成二硫鍵的主要原因,并且不同魚(yú)類(lèi),二硫鍵形成的最適溫度也不同[30-31]。如圖1所示,漂洗魚(yú)糜相比于魚(yú)肉原料,二硫鍵顯著增加,這主要是由于半胱氨酸屬于氧化敏感氨基酸,并且含有巰基,經(jīng)過(guò)氧化易形成二硫化物,在漂洗過(guò)程中活性氧攻擊蛋白質(zhì),從而形成有利于蛋白質(zhì)聚集的共價(jià)相互作用力二硫鍵。經(jīng)斬拌后,二硫鍵相比漂洗過(guò)程僅增加8%,增加幅度較小;40 ℃和90 ℃加熱后,二硫鍵分別相比于斬拌過(guò)程增加27%和93%,這說(shuō)明加熱是二硫鍵形成的主要原因,并且海鱸魚(yú)二硫鍵最佳形成溫度高于40 ℃。

圖1 魚(yú)糜加工及凝膠過(guò)程中化學(xué)作用力的變化Fig. 1 Changes in chemical forces during surimi processing and gelation

2.3 非二硫共價(jià)鍵的變化

蛋白質(zhì)的溶解度可以反映凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中形成的非二硫共價(jià)鍵的多少,非二硫共價(jià)鍵ε-(γ-Glu)-Lys的形成主要是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase,TGase)催化肌球蛋白重鏈的Glu殘基的γ-酰胺基與Lys殘基的ε-氨基之間發(fā)生交聯(lián)作用,非二硫共價(jià)鍵也是魚(yú)糜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的主要化學(xué)作用力,賦予魚(yú)糜較高的彈性和強(qiáng)度[32]。由圖2可知,在魚(yú)糜加工及凝膠形成過(guò)程中,蛋白質(zhì)溶解度先降低后升高。在前期加工過(guò)程中蛋白質(zhì)溶解度持續(xù)降低,40 ℃凝膠化魚(yú)糜相比于原料,溶解度降低了60%,說(shuō)明形成了非二硫共價(jià)鍵。目前己有研究表明,在4～40 ℃溫度范圍內(nèi),TGase均能催化形成非二硫共價(jià)鍵,增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度[33]。而經(jīng)過(guò)高溫加熱形成魚(yú)糜凝膠時(shí),蛋白溶解率顯著增大,非二硫共價(jià)鍵含量低于低溫凝膠化時(shí)的含量。劉海梅等[34]在鰱肌球蛋白膠凝過(guò)程化學(xué)鍵變化中研究發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)溶解度隨著溫度的上升先降低后升高,呈V型分布,當(dāng)溫度過(guò)高時(shí),非二硫共價(jià)鍵的形成則受到抑制,與本研究結(jié)論一致。

圖2 魚(yú)糜加工及凝膠過(guò)程中蛋白質(zhì)溶解度的變化Fig. 2 Changes in protein solubility during surimi processing and gelation

2.4 巰基的變化

在蛋白凝膠形成過(guò)程中,巰基含量的降低意味著其被氧化生成二硫鍵[35]。有研究表明,低溫(65 ℃)加熱對(duì)牛肉蛋白的巰基沒(méi)有顯著影響,而高溫加熱會(huì)導(dǎo)致巰基含量下降[36]。如圖3所示,巰基含量總體呈下降趨勢(shì);經(jīng)過(guò)漂洗,巰基含量相比原料下降了28%;而斬拌、40 ℃加熱對(duì)巰基含量影響不顯著(P＞0.05);90 ℃高溫加熱后,巰基含量再次顯著下降,相比凝膠化魚(yú)糜下降率為43%,與2.2節(jié)研究結(jié)果一致,進(jìn)一步說(shuō)明了海鱸魚(yú)糜在加工及凝膠形成過(guò)程中,凝膠特性的形成與巰基減少和二硫鍵的增多有關(guān)。

圖3 魚(yú)糜加工及凝膠過(guò)程中巰基含量的變化Fig. 3 Changes in sulfhydryl group content during processing and gelation of surimi

2.5 TCA-可溶性肽含量的變化

TCA-可溶性肽反映魚(yú)糜凝膠中小分子肽的含量,從而反映蛋白質(zhì)在內(nèi)源性組織蛋白酶作用下的水解程度,其含量與蛋白質(zhì)降解程度呈負(fù)相關(guān)[37]。由圖4可知,漂洗造成TCA-可溶性肽含量顯著降低(P＜0.05),其主要原因是蛋白質(zhì)的降解與組織蛋白酶有關(guān),而漂洗可以除去魚(yú)肉組織蛋白酶,從而有效抑制蛋白質(zhì)的降解,使TCA-可溶性肽含量從99.58 μmol/g下降至16.58 μmol/g。錢(qián)娟等[38]己證明清水漂洗可以有效抑制蛋白質(zhì)的降解。斬拌對(duì)蛋白質(zhì)降解程度無(wú)明顯影響,而經(jīng)過(guò)40 ℃低溫加熱后,TCA-可溶性肽含量顯著增大(P＜0.05),這是由于加熱使得漂洗未除盡的內(nèi)源蛋白酶活性增強(qiáng),從而加速蛋白質(zhì)的降解,導(dǎo)致TCA-可溶性肽含量增大68%。經(jīng)過(guò)90 ℃高溫加熱形成凝膠后,TCA-可溶性肽含量顯著降低(P＜0.05),因?yàn)榇藭r(shí)蛋白凝膠形成,由于蛋白質(zhì)間相互作用的關(guān)系,使得蛋白質(zhì)內(nèi)部形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),被降解程度降低,TCA-可溶性肽含量隨之減少。

圖4 魚(yú)糜加工及凝膠過(guò)程中TCA-可溶性肽含量的變化Fig. 4 Changes in TCA-soluble peptide content during processing and gelation of surimi

2.6 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

酰胺I帶(1 600～1 700 cm-1)常用來(lái)分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律[39],通常認(rèn)定1 600～1 640 cm-1波數(shù)范圍是β-折疊;1 640～1 650 cm-1波數(shù)范圍是無(wú)規(guī)卷曲;1 650～1 660 cm-1波數(shù)范圍是α-螺旋;1 660～1 695 cm-1波數(shù)范圍是β-轉(zhuǎn)角。本實(shí)驗(yàn)中,紅外光譜圖采用Peakfit 4.12軟件對(duì)酰胺I帶進(jìn)行去卷積、二階導(dǎo)和高斯擬合處理,最終使各子峰分開(kāi),利用面積比確定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化規(guī)律。

由表2可知,總體上β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲呈先下降后上升再下降的趨勢(shì),α-螺旋含量持續(xù)下降,β-轉(zhuǎn)角先上升后下降再上升。漂洗過(guò)后相比于魚(yú)肉原料,β-折疊含量下降13%,β-轉(zhuǎn)角含量上升39%,α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲含量變化不顯著(P＞0.05)。袁凱等[8]研究表明,在4 ℃條件下,隨著漂洗次數(shù)增加,β-折疊含量持續(xù)下降;盧巖[40]研究發(fā)現(xiàn),隨著H2O2濃度增加,β-折疊和α-螺旋結(jié)構(gòu)明顯減少,證實(shí)了氧化會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。因此漂洗過(guò)程中,蛋白質(zhì)氧化是導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)改變的主要原因。斬拌是魚(yú)糜凝膠制備的一道重要工序,斬拌過(guò)程中,剪切力和NaCl溶解的共同作用會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的展開(kāi)[41],Kang Zhuangli等[42]研究表明,豬肉糜中隨著NaCl添加量的增加,β-折疊相對(duì)含量有升高趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過(guò)斬拌,β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)顯著上升(P＜0.05),α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角顯著下降(P＜0.05),表明斬拌使α-螺旋解旋形成β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu);經(jīng)過(guò)40 ℃低溫加熱,相比斬拌魚(yú)糜,β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量分別增加8%和6%,無(wú)規(guī)卷曲含量下降12%,α-螺旋結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化;而當(dāng)凝膠化魚(yú)糜經(jīng)90 ℃高溫加熱形成凝膠后,β-折疊、無(wú)規(guī)卷曲和α-螺旋含量都下降,β-轉(zhuǎn)角含量顯著增加(P＜0.05)。有研究表明,高溫加熱時(shí)α-螺旋解旋主要形成β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)[19]。賈丹[43]研究發(fā)現(xiàn),青魚(yú)魚(yú)糜經(jīng)過(guò)90 ℃高溫加熱后,β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)明顯增加,而鰱魚(yú)魚(yú)糜無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)顯著增加。其原因主要由于不同魚(yú)種的蛋白構(gòu)象存在差異,從而導(dǎo)致高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能特性的差異。

表2 魚(yú)糜加工及凝膠過(guò)程中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化Table 2 Changes in protein secondary structures during surimi processing and gelation%

2.7 相關(guān)性分析

蛋白質(zhì)構(gòu)象通過(guò)蛋白質(zhì)間化學(xué)作用力維持,有研究指出,α-螺旋是依靠肌原纖維蛋白分子內(nèi)氫鍵形成的,β-折疊是依賴(lài)蛋白質(zhì)分子間氫鍵形成的[44];氫鍵和離子鍵主要維持蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu),疏水性相互作用是蛋白質(zhì)變性形成緊湊結(jié)構(gòu)的主要驅(qū)動(dòng)力。如表3所示,化學(xué)鍵之間相關(guān)關(guān)系極顯著(P＜0.01),疏水鍵和巰基與水解度顯著相關(guān)(P＜0.05);α-螺旋結(jié)構(gòu)與離子鍵、氫鍵和巰基相關(guān)系數(shù)分別為0.545、0.54、0.534,均顯著正相關(guān),與疏水鍵和二硫鍵顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為-0.620、-0.562。β-轉(zhuǎn)角與離子鍵顯著負(fù)相關(guān),與氫鍵和巰基極顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01),與疏水鍵和二硫鍵極顯著正相關(guān)(P＜0.01),相關(guān)系數(shù)為0.966。無(wú)規(guī)卷曲和β-折疊與蛋白質(zhì)間化學(xué)鍵無(wú)顯著相關(guān)性(P＞0.05);蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)不同構(gòu)象間也有一定的相關(guān)性,β-轉(zhuǎn)角與β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。

表3 魚(yú)糜加工及凝膠過(guò)程中理化指標(biāo)相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of physicochemical indicators during surimi processing and gelation process

2.8 微觀結(jié)構(gòu)變化

圖5 魚(yú)糜加工及凝膠過(guò)程中微觀結(jié)構(gòu)的變化Fig. 5 Microstructure changes during surimi processing and gelation

本研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在漂洗、斬拌以及加熱過(guò)程中都發(fā)生變化,并且這些變化與蛋白質(zhì)的聚合有一定的相關(guān)關(guān)系,而魚(yú)糜的凝膠形成是在蛋白質(zhì)間化學(xué)作用力的共同作用下形成的,并且魚(yú)糜凝膠結(jié)構(gòu)的變化是蛋白質(zhì)解聚、聚合的表觀。因此,對(duì)魚(yú)糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的研究,有利于進(jìn)一步研究魚(yú)糜加工及凝膠形成過(guò)程中蛋白質(zhì)的聚合過(guò)程。由圖5可知,漂洗對(duì)魚(yú)糜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響,而經(jīng)過(guò)斬拌后,原本疏松的魚(yú)糜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)開(kāi)始局部出現(xiàn)較大的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。在低溫加熱后,凝膠化魚(yú)糜開(kāi)始有蛋白顆粒堆積,并且網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)更為明顯,孔徑也明顯減小,但是相比于90 ℃加熱后形成的穩(wěn)定魚(yú)糜凝膠,低溫凝膠化沒(méi)有形成明顯的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。90 ℃加熱形成的魚(yú)糜凝膠結(jié)構(gòu)緊密,且可明顯看到聚集簇的形成,進(jìn)一步說(shuō)明了凝膠的形成是天然蛋白質(zhì)先發(fā)生變性解聚然后在蛋白質(zhì)間相互作用下聚合的過(guò)程。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)海鱸魚(yú)糜加工及凝膠形成過(guò)程中理化性質(zhì)的變化,發(fā)現(xiàn)造成pH值改變的主要過(guò)程是漂洗和高溫加熱,而含水量的變化主要是由于漂洗和斬拌過(guò)程對(duì)水分的調(diào)節(jié);90 ℃加熱后離子鍵、氫鍵含量顯著下降,疏水相互作用和二硫鍵形成的最適溫度均高于40 ℃,漂洗和斬拌對(duì)化學(xué)鍵的影響比加熱較小;蛋白質(zhì)水解度和蛋白質(zhì)溶解度在整個(gè)過(guò)程中都呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢(shì);漂洗對(duì)β-折疊和β-轉(zhuǎn)角影響顯著,斬拌、40 ℃加熱和90 ℃對(duì)α-螺旋、無(wú)規(guī)卷曲、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角影響顯著(P＜0.05);各指標(biāo)相關(guān)性分析可知,離子鍵和氫鍵與α-螺旋正相關(guān),氫鍵的斷裂伴隨著穩(wěn)定結(jié)構(gòu)α-螺旋解旋形成相對(duì)不穩(wěn)定的無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角,離子鍵、氫鍵、疏水鍵和二硫鍵與二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角有顯著相關(guān)性,與β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲無(wú)明顯相關(guān)性,非二硫共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)均無(wú)明顯相關(guān)性。