樹枝狀表面增強(qiáng)拉曼散射基底制備及孔雀石綠痕量檢測

趙靜晨,黃丹丹,朱樹華

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,山東 泰安 271018)

表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)是一種分析速度快、檢測靈敏度高的分析方法[1],在痕量有機(jī)物和食源性致病微生物檢測等方面有著廣泛的應(yīng)用[2-4]。研究發(fā)現(xiàn),納米結(jié)構(gòu)表面附近的分子振動(dòng)光譜信號強(qiáng)度急劇增強(qiáng)[5],因此,制備能增強(qiáng)拉曼信號的納米結(jié)構(gòu)SERS基底成為SERS研究中的熱點(diǎn)問題。金納米材料是人們最早發(fā)現(xiàn)、研究最多的納米材料之一[6],由于具有表面增強(qiáng)拉曼活性,常被用作SERS基底[7-9],金納米粒子(gold nanoparticles,Au NPs)作為SERS基底在食品安全檢測領(lǐng)域[10-14]的應(yīng)用研究受到國內(nèi)外廣泛的關(guān)注。近年來研究發(fā)現(xiàn),具有尖銳的邊緣結(jié)構(gòu)、納米尺度的節(jié)點(diǎn)以及大的比表面等特殊結(jié)構(gòu)的Au NPs具有優(yōu)越的SERS增強(qiáng)效果,較完整的具尖銳邊角的樹枝狀結(jié)構(gòu)則更加突出[15-18],在SERS檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。Feng Jiuju等[19]以聚乙烯基乙基咪唑溴化物為穩(wěn)定劑制備的樹突狀結(jié)構(gòu)具有均勻、多級分支,用作SERS基底檢測4-巰基苯甲酸檢出限為2×10-8mol/L。

殺菌劑孔雀石綠(malachite green,MG)及其在生物體內(nèi)代謝產(chǎn)生的隱形孔雀石綠(leucomalachite green,LMG)具有高毒性、易殘留和致癌性等安全隱患,我國早己將MG列為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的禁用藥物,但由于價(jià)格低廉,其使用屢禁不止[20-21]。徐寧寧等[22]將金核殼納米粒子作為SERS基底對羅非魚魚肉中的MG含量進(jìn)行加標(biāo)檢測,檢出限為1×10-8mol/L,加標(biāo)回收率為70.8%～126.0%。Yang Nan等[23]研究了金納米棒聚合物的SERS膜對魚皮表面MG的檢測,檢出限低于我國標(biāo)準(zhǔn)限量。

本實(shí)驗(yàn)以十二烷基甲基溴化哌啶(N-methyl-N-dodecylmorpholinium bromide,C12PDB)作為表面活性劑,用抗壞血酸還原氯金酸(chloroauric acid,HAuCl4)制備樹枝狀A(yù)u NPs,研究體系樹枝狀結(jié)構(gòu)的生長過程。以羅丹明6G(rhodamine 6G,R6G)為探針分子探究樹枝狀A(yù)u NPs作為SERS基底的檢測靈敏度和結(jié)果重復(fù)性。以樹枝狀A(yù)u NPs為SERS基底對水溶液及鯽魚肉提取液中的MG進(jìn)行檢測,探究MG溶液的檢出限,以期實(shí)現(xiàn)SERS光譜對MG的痕量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯽魚購于山東泰安市某超市。

氯金酸、抗壞血酸、乙酸銨(均為分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;R6G(純度95%)、LMG(純度98%) 阿拉丁試劑有限公司;MG(分析純) 天津市巴斯夫化工有限公司;鹽酸羥胺(分析純)、鹽酸 天津凱通化學(xué)試劑有限公司;二乙二醇(純度98%)、堿性氧化鋁 麥克林試劑公司。實(shí)驗(yàn)中用水均為實(shí)驗(yàn)室自制雙蒸水。

1.2 儀器與設(shè)備

JEM-1400PLUS透射式電子顯微鏡、JSM-6610LV掃描式電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社;UV-2700紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司;Smartlab SE X射線粉末衍射儀 日本理學(xué)公司;XploRATMPLUS激光拉曼光譜儀 法國Horiba Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 樹枝狀A(yù)u NPs的合成和表征

取38.79 mL一定濃度的C12PDB(依文獻(xiàn)方法自制[24-25])溶液,加入0.21 mL 1%的HAuCl4溶液,混勻后加入1 mL新鮮配制的0.1 mol/L的抗壞血酸溶液,快速混勻后室溫靜置6 h,即得到Au NPs樣品。將銅網(wǎng)浸入反應(yīng)液30 s后取出自然晾干,用透射式電子顯微鏡分析樣品形貌;用紫外-可見分光光度計(jì)檢測樣品吸光度,波長范圍400～800 nm。將反應(yīng)液4 ℃、10 000×g離心20 min,下層沉淀用雙蒸水洗滌后超聲分散在4 mL無水乙醇中制得樣品分散液,備用。

1.3.2 樹枝狀A(yù)u NPs的SERS活性

稱取96 mg R6G溶于200 mL雙蒸水中制得母液,濃度為10-3mol/L。稀釋母液配制10-9～10-6mol/L濃度的R6G溶液。取10 μL樹枝狀A(yù)u NPs分散液滴在潔凈的載玻片上,使液滴的半徑不超過0.5 cm,在不受污染的室溫環(huán)境下自然干燥,重復(fù)數(shù)次使其在顯微鏡下可見,得到載有SERS基底的載玻片,用掃描式電子顯微鏡分析基底表面分布。取R6G溶液滴在SERS基底上,自然干燥,制得R6G檢測樣品片。取適量R6G粉末在潔凈的載玻片上壓實(shí),制備普通拉曼檢測樣品片作為對照。用硅片520.7 cm-1峰進(jìn)行拉曼儀器的校正,拉曼光譜檢測時(shí)選用638 nm激發(fā)波長和50 倍物鏡,激光功率為1.5 mW,曝光時(shí)間10 s并重復(fù)3 次測量取平均值。

1.3.3 MG的SERS檢測

稱取73 mg MG溶于200 mL雙蒸水中,稀釋母液配制3×10-9～10-6mol/L濃度的MG溶液。稱取66.1 mg LMG溶于200 mL雙蒸水中,稀釋母液配制10-5mol/L濃度的LMG溶液。取10 μL MG和LMG溶液滴加到制備的SERS基底上,自然干燥,制得MG檢測樣品片。同時(shí)取適量MG粉末在潔凈的載玻片上壓實(shí),制備普通拉曼檢測樣品片,檢測條件與1.3.2節(jié)相同,重復(fù)3 次測量取平均值。

依照參考文獻(xiàn)[22,26],取4 g魚肉樣品,置于研缽中,加入0.3 mL 20%鹽酸羥胺和2 mL 0.1 mol/L乙酸銨,用鹽酸調(diào)節(jié)溶液至pH 4,對其進(jìn)行研磨約1 h。將提取液轉(zhuǎn)移至50 mL錐形瓶中,用6 mL乙腈洗滌研缽,轉(zhuǎn)移至錐形瓶中,加入2 g堿性氧化鋁后,振蕩10 min,有沉淀生成。轉(zhuǎn)移至10 mL離心管內(nèi),4 ℃、8 000×g離心15 min,上清液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,加入10 mL水、5 mL二氯甲烷和0.2 mL二乙二醇,劇烈振搖分液漏斗萃取1 h。將萃取液分成6 份每份0.45 mL,分別添加0.05 mL水和不同濃度的MG標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻,使MG濃度為3×10-9～1×10-6mol/L,取10 μL待測液滴加到制備的SERS基底上,自然干燥,制得魚肉提取液MG檢測樣品片,檢測條件與1.3.2節(jié)相同,重復(fù)3 次測量取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析并繪制表格;運(yùn)用Origin繪圖并進(jìn)行線性擬合。其中SERS增強(qiáng)因子的計(jì)算公式如下:

式中:EF為增強(qiáng)因子;ISERS為在樹枝狀A(yù)u NPs基底上收集的1×10-6mol/L(CSERS)R6G SERS譜圖中某一特征峰的拉曼信號強(qiáng)度;CRaman為能產(chǎn)生普通拉曼信號的R6G溶液的濃度,為1×10-3mol/L,其在同一特征峰處的拉曼信號強(qiáng)度為IRaman。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹枝狀A(yù)u NPs的制備與表征

圖1 Au NPs的透射式電子顯微鏡圖像Fig. 1 TEM images of the Au NPs at different reaction times

隨著反應(yīng)進(jìn)行,被還原的金顆粒逐漸吸附在晶核上,受表面活性劑在晶核特定晶面吸附的影響,晶體在不同的反應(yīng)階段于特定的方向上生長。透射式電子顯微鏡照片(圖1)可以觀察到,當(dāng)C12PDB/HAuCl4濃度比為4.6時(shí),Au NPs的形態(tài)隨反應(yīng)時(shí)間的延長而不斷變化,最終形成具有各向異性生長的一、二級枝莖結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)的樹枝狀結(jié)構(gòu)。X射線衍射圖譜(圖1f)中在38.2°、44.4°、65.6°、77.5°和81.7°出現(xiàn)明顯衍射峰,表明所制備的樹枝狀結(jié)構(gòu)Au NPs具有很好的結(jié)晶性,各衍射峰分別對應(yīng)Au(111)、Au(200)、Au(220)、Au(311)和Au(222)晶面,即此Au NPs為具有面心立方結(jié)構(gòu)的金晶體(JCPDS No.04-0784)。

2.2 C12PDB/HAuCl4濃度比對Au NPs形貌的影響

圖2 C12PDB/HAuCl4濃度比為2（a）、4.6（b）、12（c）時(shí)Au NPs的透射式電子顯微鏡圖像及相應(yīng)紫外-可見吸收光譜（d）Fig. 2 TEM images of Au NPs synthesized at different concentrationratios of C12PDB/HAuCl4: 2 (a), 4.6 (b), 12 (c), the corresponding UV-vis spectra (d)

為了研究表面活性劑濃度的變化對最終產(chǎn)物形貌的影響,對不同C12PDB/HAuCl4濃度比下制得的Au NPs的形貌進(jìn)行了表征。透射式電子顯微鏡照片(圖2)可以觀察到,C12PDB濃度的變化對最終產(chǎn)物的形貌影響較大。紫外-可見光譜(圖2d)中在500 nm波長到近紅外區(qū)域均有很寬的紫外吸收帶,其中濃度比為4.6時(shí),樹枝狀A(yù)u NPs在570 nm波長附近有較明顯的紫外吸收峰,這屬于多級分支橫向局部表面等離子體共振。對比圖2a～c可看到只有當(dāng)濃度比為4.6時(shí)得到產(chǎn)物的樹枝狀結(jié)構(gòu)對稱完美,本實(shí)驗(yàn)中以此條件下制備的Au NPs用于進(jìn)一步檢測。

2.3 樹枝狀A(yù)u NPs的SERS活性

為了探究樹枝狀A(yù)u NPs的SERS性能,制備了樹枝狀A(yù)u NPs SERS基底并以R6G為探針分子收集了拉曼信號。Au NPs基底照片(圖3a),可以觀察到明顯的金棕色Au NPs沉淀附著在載玻片表面。從樹枝狀A(yù)u NPs基底的掃描式電子顯微鏡圖(圖3b)可知基底表面的樹枝狀A(yù)u NPs大都聚集在一起,形成均勻的致密堆積。由圖3c可知,在沒有增強(qiáng)基底的情況下,作為對比的R6G普通拉曼譜線接近于平線,難以觀察到明顯的特征峰,而樹枝狀A(yù)u NPs基底對R6G具有顯著的SERS增強(qiáng)作用。據(jù)研究[27-28],譜圖中所標(biāo)示的特征峰分別歸屬于C—C—C面內(nèi)彎曲振動(dòng)(613 cm-1)、 C—H面外彎曲振動(dòng)(774 cm-1)、C—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)(1 185 cm-1)、C—O—C伸縮振動(dòng)(1 311 cm-1)、C—C伸縮振動(dòng)(1 361、1 510、1 574、1 649 cm-1)。不同濃度R6G(10-9～10-6mol/L)的SERS信號的強(qiáng)度隨著R6G濃度的降低而降低,當(dāng)濃度低至3×10-9mol/L時(shí)仍可識別這些特征峰。而Sun Hongbao等[28]在SERS膠帶上收集的R6G的特征峰在濃度不低于5×10-8mol/L時(shí)才能被辨識。顯然,樹枝狀A(yù)u NPs具有很好的SERS活性,大大增強(qiáng)了拉曼信號。計(jì)算可知這些特征峰強(qiáng)度與R6G濃度(3×10-9～3×10-7mol/L)的對數(shù)具有良好的線性關(guān)系。線性回歸方程:I(613 cm-1)=24 994.4+2 638.1 lg C,R2= 0.992;I(774 cm-1)=22 284.9+2 263.9 lg C,R2= 0.992;I(1 510 cm-1)=24 549.7+2 510.5 lg C,R2= 0.990;I(1 649 cm-1)=18 995.3+1 906.8 lg C,R2= 0.996。以上結(jié)果表明制備的樹枝狀A(yù)u NPs作為SERS基底表現(xiàn)出較好的拉曼增強(qiáng)效果且具有較高的靈敏度。

圖3 樹枝狀A(yù)u NPs基底照片（a）、掃描式電子顯微鏡照片（b）、不同濃度R6G的SERS譜圖和R6G的普通拉曼圖（c）和1×10－6 mol/L R6G在樹枝狀A(yù)u NPs基底上的10 個(gè)隨機(jī)點(diǎn)的SERS譜圖（d）Fig. 3 Photograph (a) and SEM image (b) of dendritic Au NPs substrate, original Raman spectra and SERS spectra for R6G (c) and SERS spectra for 1 × 10?6 mol/L R6G from 10 random locations on the dendritic Au NPs substrates (d)

同時(shí),在基底上10 個(gè)隨機(jī)點(diǎn)收集1×10-6mol/L R6G的SERS光譜研究SERS基底的檢測結(jié)果重復(fù)性,如圖3d所示,所獲得的10 個(gè)SERS譜圖都顯示出非常相似的形狀和信號強(qiáng)度,R6G的所有拉曼特征峰的相對強(qiáng)度基本不變。計(jì)算10 個(gè)SERS譜圖的部分特征峰強(qiáng)度分布可知,在613、774、1 510 cm-1和1 649 cm-1處強(qiáng)度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)分別為9.70%、6.99%、9.25%和8.77%,均低于10%,低于Sun Hongbao等[28]近16%的RSD值,表明制備的樹枝狀A(yù)u NPs基底的SERS檢測結(jié)果具有良好的重復(fù)性。將圖3中測得的SERS信號強(qiáng)度,計(jì)算增強(qiáng)因子[29],可知制備的SERS基底對R6G具有較高的增強(qiáng)因子[18,30],分別為1.4×105(613 cm-1)、1.3×105(774 cm-1)、1.5×105(1 510 cm-1)、7.6×104(1 649 cm-1)。

2.4 MG的SERS檢測

圖4 1×10－5 mol/L LMG和MG的SERS光譜（a）、不同濃度MG在樹枝狀A(yù)u NPs基底上的SERS光譜（b）和1 168 cm－1特征峰的SERS強(qiáng)度與MG濃度對數(shù)的線性關(guān)系（c）Fig. 4 SERS spectra for 1 × 10－5 mol/L LMG and MG (a), SERS spectra for MG on the dendritic Au NPs substrates (b), and linear relationship between the SERS intensity of the characteristic peak at 1 168 cm–1 and the logarithm of MG (c)

圖4 a為MG和LMG溶液在樹枝狀A(yù)u NPs基底上的SERS光譜圖,可以觀察到二者的SERS譜圖的形狀和信號相對強(qiáng)度無明顯差異[31],主要的拉曼特征峰位置相同,因此選擇MG為主要檢測對象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖4b為在樹枝狀A(yù)u NPs基底上收集的MG(3×10-9～1×10-6mol/L)SERS譜圖,SERS信號的強(qiáng)度隨著MG濃度的降低而降低。SERS光譜圖特征峰[22-23]歸屬分別為C—H面外彎曲振動(dòng)(792 cm-1)、環(huán)骨架徑向振動(dòng)(913 cm-1)、C—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)(1 1 6 8、1 2 1 4 c m-1)、苯環(huán)伸縮振動(dòng)(1 363、1 389 cm-1)和C—C伸縮振動(dòng)(1 288、1 585、1 613 cm-1)。當(dāng)濃度低至1×10-8mol/L時(shí)仍能夠檢測出這些特征峰的微弱信號,而在更低濃度下則不易識別。與前人研究報(bào)道的被檢測物拉曼信號強(qiáng)度隨濃度變化趨勢相似[32],在1×10-8～1×10-5mol/L范圍內(nèi),隨著MG濃度的增大,SERS信號強(qiáng)度呈增長趨勢,起初增長速度緩慢,當(dāng)MG濃度大于3×10-7mol/L時(shí),SERS信號急劇增強(qiáng)(圖4c)。當(dāng)濃度在1×10-8～3×10-7mol/L之間時(shí),1 168 cm-1的振動(dòng)峰信號強(qiáng)度與MG濃度的對數(shù)之間具有良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為I= 15 616.6+1 610.1 lgC,R2= 0.995。結(jié)果表明,樹枝狀A(yù)u NPs作為SERS基底靈敏度較高,可檢出痕量濃度的MG。

將鯽魚肉提取液樣品和添加MG溶液(3×10-9～1×10-6mol/L)的鯽魚肉提取液樣品進(jìn)行SERS檢測。由圖5可知,空白的Au NPs基底的SERS譜圖接近平線,對MG檢測無影響。鯽魚肉提取液樣品中未檢出MG的拉曼信號,而加標(biāo)魚肉提取液樣品中MG的SERS譜圖與MG標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS譜圖形狀相似,但由于魚肉中其他非目標(biāo)物質(zhì)的干擾,SERS信號強(qiáng)度稍低于相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,樣品加標(biāo)回收率為81.6%～102.1%,RSD為3.68%～7.98%(表1)。結(jié)果表明,樹枝狀A(yù)u NPs SERS基底可用于鯽魚肉中MG的檢測,此類SERS基底對鯽魚中MG的測定結(jié)果可靠。

圖5 鯽魚肉提取液及其加標(biāo)回收樣品的MG在樹枝狀A(yù)u NPs基底上的SERS光譜Fig. 5 SERS spectra for MG in C. auratus extract without and with MG standard addition on the dendritic Au NPs substrates

表1 加標(biāo)鯽魚肉中MG的回收率（n= 3）Table 1 Recoveries of MG in C. auratus (n= 3)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)提出了一種利用表面活性劑輔助快速制備樹枝狀A(yù)u NPs SERS基底的方法,研究不同的C12PDB/HAuCl4濃度比對樹枝狀結(jié)構(gòu)的影響。制得的樹枝狀A(yù)u NPs作為SERS基底具有優(yōu)異的拉曼活性且結(jié)果重復(fù)性較好,可測得最低濃度為3×10-9mol/L時(shí)R6G的拉曼特征峰,SERS增強(qiáng)因子約為105。此類樹枝狀A(yù)u NPs作為SERS基底可檢測水溶液中的MG檢出限為1×10-8mol/L,對鯽魚肉樣品中的MG加標(biāo)回收率為81.6%～102.1%,可實(shí)際應(yīng)用于魚肉中的MG檢測。本研究對食品安全檢測中SERS分析技術(shù)的應(yīng)用具有重要意義。