納米銅/低密度聚乙烯復(fù)合膜在乳制品中的銅遷移

盧 珊,胡長(zhǎng)鷹,,*,張勤軍,鐘懷寧,胡曉紅

(1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系,廣東 廣州 510632;2.廣東省普通高校產(chǎn)品包裝與物流重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 珠海 519070;3.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣東 廣州 510623)

納米材料應(yīng)用于食品包裝中[1-4],除了能改善包裝的機(jī)械性能[5]、阻隔性[6]外,還能使包裝具有良好的抗菌效果[7-10],從而使食品貨架期延長(zhǎng)。在納米金屬?gòu)?fù)合包裝材料中,納米銅具有廣譜抗菌性,對(duì)抑制革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌及酵母菌都有效果[11]。因此,納米銅在食品包裝中具有一定應(yīng)用前景[12]。

己有研究表明,納米材料應(yīng)用于食品包裝中,會(huì)通過(guò)擴(kuò)散、表面解吸附或溶解等方式釋放到食品中[13-14],進(jìn)而對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在危害[15]。所以,在納米材料應(yīng)用之前,需要對(duì)其進(jìn)行充分的安全性評(píng)估。納米材料的遷移研究是安全性評(píng)估的重要環(huán)節(jié)[16],目前,納米銅復(fù)合包裝材料的遷移研究主要注重納米銅在食品模擬物中的遷移研究[17-19],關(guān)于納米銅在真實(shí)食品中的遷移研究較少[20]。雖然使用食品模擬物能使遷移實(shí)驗(yàn)更加方便,但是,常規(guī)的遷移方法中使用的食品模擬液是否適用于有著特殊性能的納米復(fù)合包裝材料還值得商榷[21]。

為了研究納米銅在真實(shí)食品中的遷移行為,本實(shí)驗(yàn)選擇乳制品為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,而市場(chǎng)上乳制品的包裝大部分為利樂(lè)包,利樂(lè)包的內(nèi)層由低密度聚乙烯(low density polyethylene,LDPE)制成。本實(shí)驗(yàn)選擇LDPE為基材,主要研究納米銅/LDPE復(fù)合膜中銅在純?nèi)楹退崛橹械倪w移,對(duì)比復(fù)合膜中銅在乳制品及其對(duì)應(yīng)食品模擬物的遷移,重點(diǎn)考察現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于食品模擬液的選擇在納米銅遷移研究中的適用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純牛乳、風(fēng)味發(fā)酵乳 市購(gòu);LDPE母粒 陶氏杜邦有限責(zé)任公司;納米銅粉(平均粒徑50 nm,純度99%) 阿拉丁試劑(上海)有限公司;濃硝酸(色譜純)、調(diào)諧液 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;過(guò)氧化氫(30%、優(yōu)級(jí)純) 廣州化學(xué)試劑廠;一級(jí)水(18.2 MΩ/cm)由Millipore純水系統(tǒng)制得;銅標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL) 國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心;Ge、Y標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL) 美國(guó)O2si公司;無(wú)水乙醇(分析純) 廣州化學(xué)試劑廠;冰乙酸(分析純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MEDU-22/40型雙螺桿擠出造粒機(jī) 廣州市普同實(shí)驗(yàn)分析儀器有限公司;小型流延膜實(shí)驗(yàn)機(jī) 佛山市金中河機(jī)械有限公司;ETHOS UP微波消解系統(tǒng) 意大利Milestone有限公司;ICP RQ電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductive coupled plasma-mass spectrometry,ICP-MS)儀美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;Optima 8000電感耦合等離子體發(fā)射光譜(inductively coupled plasma optical emission spectrometry,ICP-OES)儀 美國(guó)PerkinElmer公司;SHA-B水浴恒溫振蕩器 金壇市醫(yī)療儀器廠;V5平面袋真空保鮮機(jī) 深圳瑞朗克斯科技有限公司;ST5000實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 奧豪斯儀器(常州)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 膜的制備

將LDPE母粒和納米粉末充分混勻后通過(guò)造粒機(jī)進(jìn)行造粒,重復(fù)造粒3 次[22],得到納米銅/LDPE復(fù)合母粒,料筒1～9 區(qū)的溫度分別為155、155、165、165、165、165、165、165、165 ℃;模頭溫度為165 ℃。造粒完成后將復(fù)合母粒用小型流延膜實(shí)驗(yàn)機(jī)進(jìn)行流延成膜,得到納米銅/LDPE復(fù)合膜,流延機(jī)1～3 區(qū)的溫度分別為180、185、185 ℃,合流區(qū)溫度為190 ℃,模具區(qū)溫度為195 ℃。納米銅和LDPE母粒的比例見(jiàn)表1。CF-0.5的厚度為(74.80±6.272)μm,密度為(0.827 2±0.017 98)g/cm3。C F-1的厚度為(7 3.6 8±7.5 3 5)μ m,密度為(0.878 5±0.012 37)g/cm3。

表1 復(fù)合膜中各組分的配比Table 1 Formulation of composite films%

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

使用體積分?jǐn)?shù)為1%的硝酸溶液將Cu標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)和Ge、Y標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)進(jìn)行逐級(jí)稀釋,配制Cu標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0.1、1、5、10、20、50 μg/L的微波消解-ICP-MS標(biāo)準(zhǔn)工作液;Ge、Y內(nèi)標(biāo)使用液質(zhì)量濃度為20 μg/L。內(nèi)標(biāo)使用液由三通管在線加入ICP-MS。

分別使用體積分?jǐn)?shù)為3%和4%的乙酸溶液將Cu(1 000 μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋為0.5、1、2、5、10、20 μg/mL的ICP-OES標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 遷移實(shí)驗(yàn)

常用于牛乳包裝的利樂(lè)包里層通常為L(zhǎng)DPE,本實(shí)驗(yàn)為了模擬牛乳包裝內(nèi)層與牛乳的實(shí)際接觸情況,并保持牛乳在遷移過(guò)程中的完整性,選擇制袋法進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)。GB 23296.1—2009《食品接觸材料及制品遷移試驗(yàn)通則》[23]中規(guī)定遷移實(shí)驗(yàn)中,采用袋裝實(shí)驗(yàn)的表面積-體積比一般為2 dm2食品接觸面積比100 mL食品模擬物。用封口機(jī)將納米銅/LDPE復(fù)合膜制成6 cm×10 cm的食品包裝袋,裝入30 mL的食品或者食品模擬液,再將包裝袋密封嚴(yán)實(shí),根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求,在一定的遷移溫度和遷移時(shí)間條件下進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn)完成后,待樣品冷卻至室溫后,將樣品取出裝好存放在4 ℃的冰箱中待測(cè)。每組3 個(gè)平行,同時(shí)做空白對(duì)照。

1.3.4 樣品前處理

1.3.4.1 乳制品的前處理

稱取乳制品2 g左右(精確到0.000 1 g)放入聚四氟乙烯消解罐內(nèi),加入5 mL濃硝酸,加蓋靜置1 h以上,再加入2 mL H2O2,旋緊外蓋后放入微波消解儀中進(jìn)行消解,微波消解程序[24]見(jiàn)表2。微波消解程序完成后,取出聚四氟乙烯罐,緩慢旋開(kāi)外蓋后用少量的一級(jí)水沖洗內(nèi)蓋,將消解罐在超聲水浴箱中超聲脫氣10 min,用一級(jí)水將溶液轉(zhuǎn)移并定容到100 mL容量瓶中,再用0.45 μm針式過(guò)濾器過(guò)濾后進(jìn)行測(cè)定。

表2 微波消解程序Table 2 Microwave digestion program

1.3.4.2 食品模擬液的前處理

由于50%乙醇溶液無(wú)法直接用ICP-MS進(jìn)行檢測(cè),需進(jìn)行一定的前處理。準(zhǔn)確量取10 mL的50%乙醇模擬液于25 mL具塞試管中,將試管放置在氮吹儀中進(jìn)行氮吹處理,當(dāng)溶液體積低于5 mL時(shí)取出試管,用1%的硝酸溶液將樣品溶液定容到25 mL容量瓶中,用0.45 μm針式過(guò)濾器過(guò)濾后進(jìn)行測(cè)定。銅向乙酸中的遷移檢測(cè)方法己由課題組劉芳等[19]建立,因此3%和4%乙酸模擬液無(wú)需前處理,可直接用ICP-OES進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 儀器工作條件

用調(diào)諧液對(duì)ICP-MS進(jìn)行優(yōu)化,確保儀器靈敏度、背景強(qiáng)度、雙離子強(qiáng)度等在制定范圍內(nèi)。優(yōu)化后ICP-MS和ICP-OES的工作參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 ICP-MS和ICP-OES操作條件Table 3Operating conditions of ICP-MS and ICP-OES

1.3.6 方法的線性相關(guān)性、曲線穩(wěn)定性檢出限和定量限

以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各元素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),各元素與內(nèi)標(biāo)計(jì)數(shù)值的比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)曲線的高、中、低質(zhì)量濃度點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)6 次測(cè)定,觀察曲線的穩(wěn)定性。對(duì)11 份樣品空白進(jìn)行測(cè)定,以測(cè)量結(jié)果3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為方法的檢出限,以測(cè)量結(jié)果10 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為方法的定量限。

1.3.7 加標(biāo)回收率和精密度測(cè)定

在空白膜制成的包裝袋中加入30 mL純?nèi)?再分別加入15 μL的100 mg/L的銅標(biāo)準(zhǔn)溶液、15 μL的1 000 mg/L的銅標(biāo)準(zhǔn)溶液、75 μL的1 000 mg/L的銅標(biāo)準(zhǔn)溶液分別使加標(biāo)質(zhì)量濃度為0.05、0.5、2.5 mg/L。按照1.3.3節(jié)進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)之后按1.3.4.1節(jié)進(jìn)行前處理,每個(gè)添加水平進(jìn)行6 次測(cè)定,同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

1.3.8 遷移量的計(jì)算

乳制品中及不同溶液中銅遷移量的計(jì)算如式(1)～(4)所示:

式中:M1、M2、M3、M4分別為乳制品、50%乙醇、3%乙酸、4%乙酸模擬液中銅的遷移量/(μg/kg);Ci1和Ci2分別為ICP-MS測(cè)得的乳制品、50%乙醇經(jīng)前處理后的銅的質(zhì)量濃度/(μg/L);Ci3和Ci4分別為ICP-OES測(cè)得的3%、4%乙酸中銅的質(zhì)量濃度/(μg/L);V為試樣消化液定容的體積/mL;fi為試樣稀釋倍數(shù);m1為稱取乳制品的質(zhì)量/g;m2為30 mL 50%乙醇的質(zhì)量/g;m3和m4分別為30 mL 3%和4%乙酸的質(zhì)量/g。

1.3.9 遷移實(shí)驗(yàn)

1.3.9.1 納米銅/LDPE復(fù)合膜中銅在乳制品中的遷移

實(shí)驗(yàn)探究納米銅/LDPE復(fù)合膜中銅在純?nèi)楹退崛橹械倪w移。按照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)后按1.3.4.1節(jié)進(jìn)行樣品前處理,同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。遷移量為遷移后乳制品中的銅含量與乳制品本身含有的銅含量之差。

1.3.9.2 納米銅/LDPE復(fù)合膜中銅在乳制品及其對(duì)應(yīng)的食品模擬物中的遷移對(duì)比

GB 31604.1—2015《食品接觸材料及制品遷移試驗(yàn)通則》[25]以及歐盟標(biāo)準(zhǔn)EU 10/2011[26]中規(guī)定,純?nèi)閷?duì)應(yīng)的食品模擬物均為50%乙醇溶液,而對(duì)于酸乳的食品模擬物的規(guī)定則不一樣,國(guó)標(biāo)規(guī)定體積分?jǐn)?shù)4%乙酸為酸乳的食品模擬物,而歐盟規(guī)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%乙酸為酸乳的食品模擬物。實(shí)驗(yàn)分別選擇了50%乙醇、3%乙酸及4%乙酸3 種食品模擬液進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn),并且對(duì)比納米銅在真實(shí)食品中的遷移,以考察現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于食品模擬液的選擇在納米成分遷移研究中的適用性。按照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn),3%乙酸和4%乙酸溶液中銅質(zhì)量濃度用ICPOES進(jìn)行定量測(cè)定,50%乙醇溶液需按照方法1.3.4.2節(jié)進(jìn)行前處理后用ICP-MS進(jìn)行定量分析。

1.3.9.3 紫外照射處理后的復(fù)合膜中銅在乳制品中的遷移

紫外光常用于食品接觸材料的消毒,為研究紫外照射對(duì)遷移的影響,在遷移實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前用紫外照射處理納米銅/LDPE復(fù)合膜。將裁剪好的納米銅/LDPE復(fù)合膜均勻放置在紫外波長(zhǎng)為254 nm的環(huán)境中處理30 min,按照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)后按1.3.4.1節(jié)進(jìn)行樣品前處理。

1.3.9.4 蒸煮條件下復(fù)合膜中銅在純?nèi)橹械倪w移

純?nèi)榘b在實(shí)際使用過(guò)程中可能會(huì)涉及蒸煮條件,為了研究納米銅在蒸煮狀態(tài)下在純?nèi)檫w移的情況,因此將灌裝好牛乳的包裝袋在蒸煮條件下進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)。取1 000 mL燒杯裝入適量純水,置于電熱板上加熱到水沸騰,沸騰后將灌裝好樣品的納米銅/LDPE復(fù)合包裝袋浸沒(méi)在沸水中15 min。按照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)后按1.3.4.1節(jié)進(jìn)行樣品前處理,同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Office軟件Excel對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖,用Minitab 17對(duì)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析,采用t檢驗(yàn),取95%置信度,差異顯著,P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的建立

ICP-MS檢測(cè)銅元素的方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5 600.077 2x+189.734 1,儀器檢出限為0.016 μg/L,方法檢出限為8.42 μg/kg,方法定量限為28.06 μg/kg。相關(guān)系數(shù)r＞0.999 9,這說(shuō)明用ICP-MS法檢測(cè)銅在0.10～50.00 μg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%,說(shuō)明曲線比較穩(wěn)定。用微波消解結(jié)合ICP-MS法檢測(cè)銅在乳制品中的遷移,方法的加標(biāo)回收率在97.46%～107.30%之間,精密度在1.98%～6.06%之間,說(shuō)明此方法滿足分析測(cè)定的要求。

2.2 遷移結(jié)果

2.2.1 納米銅/LDPE復(fù)合膜中銅在乳制品中的遷移

圖1 納米銅/LDPE復(fù)合膜中銅在乳制品中的遷移（n=3）Fig. 1 Migration of nano-copper from nano-copper/LDPE composite film to milk products (n = 3)

圖1 顯示,銅在純?nèi)橹械倪w移量為46.32～64.21 μg/kg,在酸乳中的遷移量為49.91～171.57 μg/kg。不論是在純?nèi)橹羞€是酸乳中,CF-1比CF-0.5中銅的遷移量大(P＜0.05),這說(shuō)明,復(fù)合膜中納米銅的添加量對(duì)納米銅的遷移量有影響,這與其在食品模擬液中遷移的規(guī)律一致[27]。同時(shí),從圖1還可以看出,納米銅在酸乳中的遷移量比純?nèi)橹懈叱?.59～107.37 μg/kg。在CF-1中,當(dāng)納米銅初始添加量為1%時(shí),差異更為明顯(P＜0.05)。用pH計(jì)測(cè)得純?nèi)榈膒H 6.64,酸乳的pH 4.18,推測(cè)可能是因?yàn)樗崛榈膒H值比純?nèi)樾?符合納米銅在酸性大的溶液中更容易發(fā)生遷移行為的規(guī)律[27]。

2.2.2 納米銅/LDPE復(fù)合膜中銅在乳制品和食品模擬液中的遷移對(duì)比

食品模擬液是能夠接近真實(shí)地反映食品接觸材料及制品中組分向與之接觸的食品中的遷移,具有某類食品的典型共性,用于模擬食品進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)的測(cè)試介質(zhì)[25]。從圖2可以看出,納米銅/LDPE復(fù)合膜中銅在純?nèi)橹械倪w移量比向50%乙醇溶液中的遷移量高出39.19～48.94 μg/kg,且存在顯著性差異(P＜0.05);但從圖3發(fā)現(xiàn),納米銅在酸乳中的遷移量遠(yuǎn)小于在3%和4%乙酸溶液中的遷移量(P＜0.05),差值分別在1 598.66～1 760.92 μg/kg和1 868.97～2 159.58 μg/kg之間。這說(shuō)明,用50%乙醇溶液模擬牛乳,以及用3%和4%乙酸模擬酸乳進(jìn)行納米復(fù)合膜中納米金屬的遷移實(shí)驗(yàn)并不合適,需要選擇更為合適的食品模擬液代替真實(shí)食品進(jìn)行遷移研究。

圖2 納米銅/LDPE復(fù)合膜中銅在純?nèi)楹?0%乙醇溶液中的遷移（n=3）Fig. 2 Migration of nano-copper from nano-copper/LDPE composite film to pure milk and 50% ethanol solution (n = 3)

圖3 納米銅/LDPE復(fù)合膜中銅在酸乳和乙酸溶液中的遷移（n=3）Fig. 3 Migration of nano-copper from nano-copper/LDPE composite film to yogurt and acetic acid solution (n = 3)

2.2.3 紫外照射處理的納米銅/LDPE復(fù)合膜中銅在乳制品中的遷移

圖4 紫外照射處理的納米銅/LDPE復(fù)合膜中銅在乳制品中的遷移（n=3）Fig. 4 Migration of nano-copper in UV-treated nano-copper/LDPE composite film to milk products (n = 3)

如圖4所示,紫外照射處理復(fù)合膜后,復(fù)合膜中銅在純?nèi)楹驮谒崛橹械倪w移規(guī)律與2.2.1節(jié)一致,即當(dāng)納米銅添加量為1%時(shí),納米銅在酸乳中的遷移量顯著高于在純?nèi)橹械倪w移量。但經(jīng)過(guò)紫外照射處理后的復(fù)合膜與未經(jīng)紫外照射處理的復(fù)合膜中銅在純?nèi)楹退崛橹械倪w移無(wú)顯著差異(P＞0.05),說(shuō)明紫外照射對(duì)納米銅的遷移沒(méi)有影響。

2.2.4 蒸煮處理的納米銅/LDPE復(fù)合膜中銅向乳制品中的遷移

圖5 100 ℃、15 min條件下納米銅/LDPE復(fù)合膜中銅在純?nèi)橹械倪w移（n=3）Fig. 5 Migration of nano-copper from nano-copper/LDPE composite film to pure milk after 15 min cooking at 100 ℃ (n = 3)

如圖5所示,經(jīng)蒸煮處理的復(fù)合膜中銅的遷移量在23.63～60.35 μg/kg之間,說(shuō)明,在模擬蒸煮這種惡劣條件下,即使如本實(shí)驗(yàn)選用較大添加量的納米銅(一般不超過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%),納米銅在純?nèi)橹械倪w移量也遠(yuǎn)小于GB 9685—2016《食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[28]及EU 2016/1416[29]規(guī)定中的特定遷移量為5 mg/kg。但盡管如此,復(fù)合膜中遷移出的納米銅在溶液中可能以離子形態(tài)或納米粒子形態(tài)存在,當(dāng)以納米粒子形態(tài)遷移時(shí),其毒理機(jī)制復(fù)雜,有待進(jìn)一步的毒理學(xué)研究[30],而納米銅的遷移形態(tài)和毒理也正是課題組后期的研究重點(diǎn)。

3 結(jié) 論

納米材料作為一種非常有應(yīng)用前景的材料,在其應(yīng)用于市場(chǎng)前應(yīng)該進(jìn)行充分的安全性評(píng)估。本實(shí)驗(yàn)建立納米銅/LDPE復(fù)合膜中銅向牛乳中的遷移檢測(cè)方法,方法檢出限為8.42 μg/L,方法定量限為28.06 μg/L,方法回收率和精密度均滿足分析方法建立的要求。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),食品基質(zhì)的pH值可能會(huì)對(duì)納米銅的遷移產(chǎn)生影響,當(dāng)納米銅添加量為1%時(shí),復(fù)合膜中銅在酸乳中的遷移量顯著大于在純?nèi)橹械倪w移量。但總體來(lái)說(shuō),納米銅向乳制品中的遷移量比較小,在遷移實(shí)驗(yàn)中,納米銅在純?nèi)橹械淖畲筮w移量不超過(guò)65 μg/kg,在酸乳中的遷移量也不超過(guò)190 μg/kg,遠(yuǎn)低于法規(guī)中的限量。同時(shí),在納米銅的遷移實(shí)驗(yàn)中,用50%乙醇作為純?nèi)榈氖称纺M物、3%和4%乙酸作為酸乳的食品模擬物都不能很好地和相應(yīng)的乳制品吻合,說(shuō)明現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)純?nèi)楹退崛槟M物的設(shè)定不適用于納米銅,應(yīng)尋找更合適的食品模擬物模擬納米銅在乳制品中的遷移實(shí)驗(yàn)。