叉葉茅膏菜組培快繁的研究

許 鳳，張藝萍,,宋 杰，楊秀梅，王麗花，蘇 艷，張麗芳，瞿素萍*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所，云南 昆明 650205；2.國(guó)家觀賞園藝工程研究中心，云南 昆明 650205；3.云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650205)

茅膏菜(DroseraspatulataJ. E. Smith)為茅膏菜科(Droseraceae)茅膏菜屬(Drosera)植物，又稱石龍牙草、地上明珠等，在我國(guó)主要分布于長(zhǎng)江以南和東北等地區(qū)，生于潮濕的山坡草地、灌叢、疏林及小溪流旁邊等[1-2]。作為藥用植物，茅膏菜具有解瘡毒等功效[3]，同時(shí)其新奇的外形以及所獨(dú)有的食蟲(chóng)植物的特殊形態(tài)結(jié)構(gòu),在花卉園藝界有著相當(dāng)高的觀賞價(jià)值，是一種極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物[4-7]。目前，有關(guān)茅膏菜屬植物的研究主要集中于其藥用價(jià)值[8-16]、食蟲(chóng)機(jī)制[17-18]、生態(tài)學(xué)研究[18-19]，對(duì)于其繁育技術(shù)的研究只限于少數(shù)種[20-24]。

隨著市場(chǎng)需求量的不斷增大，現(xiàn)有茅膏菜的數(shù)量已經(jīng)供不應(yīng)求，同時(shí)由于生態(tài)環(huán)境日益受損，濕地及林地資源不斷縮減，茅膏菜家族已經(jīng)瀕臨滅絕[25],對(duì)茅膏菜進(jìn)行組織培養(yǎng)和離體快繁,可短期內(nèi)培養(yǎng)出大量生長(zhǎng)健壯、均勻一致的優(yōu)質(zhì)種苗,能夠有效挽救匱乏的種質(zhì)資源，填補(bǔ)市場(chǎng)供應(yīng)的空缺。目前，并未見(jiàn)有關(guān)于叉葉茅膏菜組織培養(yǎng)的報(bào)道,因此本研究對(duì)于食蟲(chóng)植物的資源保護(hù)及應(yīng)用推廣具有重要意義[22]。

1 材料與方法

1.1 材料

供試叉葉茅膏菜為2018年引自浙江省嘉興市，栽植于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所品種資源圃。于春夏季茅膏菜生長(zhǎng)旺盛季節(jié)，花序伸直未顯色時(shí)，剪下作為外植體。

1.2 外植體的消毒

參照楊爽等[22]的方法，并進(jìn)行改進(jìn)。具體方法為：將剪下的花序，用洗衣粉水清洗一遍后，在自來(lái)水下沖洗15～20 min。放入超凈工作臺(tái)，使用75%酒精處理30 s，再用0.15%氯化汞溶液處理5～8 min，之后用0.5%次氯酸鈉混合液(100 mL 0.5%次氯酸鈉溶液加入2滴吐溫20配制而成)消毒10～20 min，具體設(shè)置見(jiàn)表1，最后用無(wú)菌水沖洗5次。

表1 外植體消毒試驗(yàn)

1.3 愈傷組織的誘導(dǎo)

外植體消毒完成后，用無(wú)菌濾紙將表面水分吸干，把花序底部的花序軸切除0.5 cm左右，然后把處理好的花序接種于不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置不同濃度的6-BA、KT、NAA共組成6個(gè)組合(表2)。

表2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基

1.4 叉葉茅膏菜的愈傷組織分化

選取生長(zhǎng)情況一致的愈傷組織團(tuán)，每團(tuán)0.1 g，以MS為基本培養(yǎng)基，根據(jù)表3中的組合。每個(gè)組合分別接種3瓶，每瓶接種5團(tuán)愈傷組織。在光照16 h/8 h(光/暗)，溫度25 ℃/15 ℃(白天/晝夜)的條件下培養(yǎng)20 d后，對(duì)愈傷組織分化率、叢生芽苗高度、叢生芽狀態(tài)進(jìn)行觀察并統(tǒng)計(jì)(表3)。

表3 愈傷組織分化培養(yǎng)基

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑組合對(duì)叉葉茅膏菜花序消毒效果的影響

不同的消毒劑組合及處理時(shí)間對(duì)叉葉茅膏菜花序的消毒效果見(jiàn)表4。從表4可以看出，相同時(shí)間的氯化汞處理后，隨著次氯酸鈉混合液處理時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體的污染率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而褐化率卻呈上升的趨勢(shì)，外植體成活率呈上升的趨勢(shì)，這表明在氯化汞處理時(shí)間不變的前提下，延長(zhǎng)次氯酸鈉混合液的處理時(shí)間可有效降低污染率，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又會(huì)對(duì)供試材料產(chǎn)生傷害，導(dǎo)致褐化率升高，進(jìn)而影響成活率。同時(shí)，在次氯酸鈉混合液處理時(shí)間相同時(shí)，延長(zhǎng)氯化汞的處理時(shí)間，污染率降低，但褐化率卻升高。

表4 花序消毒試驗(yàn)結(jié)果

因此，本研究認(rèn)為叉葉茅膏菜花序消毒的最適宜方法：75%酒精處理30 s后用0.15%氯化汞溶液消毒8 min，之后用0.5%次氯酸混合液處理15 min。

2.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)及誘導(dǎo)叉葉茅膏菜愈傷組織發(fā)生的影響

由表5可以看出，當(dāng)NAA的濃度相同時(shí)，隨著6-BA、KT濃度的提高，愈傷組織團(tuán)的形成時(shí)間縮短，且愈傷組織的狀態(tài)從致密向疏松變化。同時(shí)，從圖1可以看出，當(dāng)6-BA、KT的濃度達(dá)到2.0 mg/L時(shí)，愈傷組織出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，因此，叉葉茅膏菜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基應(yīng)選擇B2、B5培養(yǎng)基。

圖1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑影響下產(chǎn)生的愈傷組織

表5 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)叉葉茅膏菜愈傷組織發(fā)生的影響

2.3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)叉葉茅膏菜愈傷組織分化的影響

將B2和B5培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的狀態(tài)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接到8種不同的分化培養(yǎng)基上。從表6和圖2可以看出，相同濃度的不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織分化的影響是不同的，綜合愈傷組織分化率、叢生芽高度、叢生芽狀態(tài)來(lái)看，可以得出，對(duì)于愈傷組織分化影響的大小依次為：ZT>KT>6-BA>TDZ。相同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，不同濃度對(duì)愈傷組織分化的影響也是不同的，當(dāng)ZT為0.5 mg/L時(shí)，芽較高，葉片過(guò)粗，生長(zhǎng)過(guò)于成熟，不利于下一步進(jìn)行叢生苗增殖培養(yǎng)；當(dāng)ZT為0.1 mg/L，叢生苗高度適中，生長(zhǎng)一致，叢生芽較多。因此，綜合上述分析結(jié)果，本研究認(rèn)為MS+ZT 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L是叉葉茅膏菜愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基。

圖2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)叉葉茅膏菜愈傷組織分化的影響

表6 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)叉葉茅膏菜愈傷組織分化的影響

2.4 叉葉茅膏菜的生根與移栽

叉葉茅膏菜叢生苗高度為2.5 cm左右時(shí)，將其接入到不加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～15 d，再轉(zhuǎn)入到MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.1 g/L+活性炭0.2 g/L+瓊脂6 g/L+蔗糖15 g/L的生根培養(yǎng)基中。

將根長(zhǎng)0.5 cm左右的幼苗連瓶轉(zhuǎn)移到覆蓋遮陽(yáng)網(wǎng)的小拱棚中放置3～5 d，之后放入0.1%的百菌清液中浸泡10 min，沖洗干凈，插入消毒過(guò)的且含飽和水的栽培基質(zhì)(珍珠巖∶草炭=1.5∶1)中。

將種好苗的穴盤(pán)放入含接水盤(pán)的育苗箱中，之后放入覆蓋遮陽(yáng)率80%的小拱棚中，10 d后將育苗箱頂部的透氣孔打開(kāi)，之后每隔10 d向接水盤(pán)中注水進(jìn)行浸盆，30 d后可獲得移栽成活的苗。

3 討論

建立叉葉茅膏菜組培快繁體系的首要目標(biāo)是得到干凈無(wú)菌的材料，本研究結(jié)果表明：叉葉茅膏菜花序外植體最佳的消毒方法組合：75%酒精30 s+0.15%氯化汞8 min+0.5%次氯酸混合液15 min。這與張國(guó)慶[20]的70%酒精30 s+0.1%氯化汞8 min、靖晶等[21]的75%酒精5 s+0.1%氯化汞5 min、楊爽等[22]的75%酒精30～60 s+0.1%氯化汞5～10 min有一定的差異?？赡芘c本研究所用材料為花序，且為不同的品種有關(guān)。

本研究認(rèn)為誘導(dǎo)叉葉茅膏菜產(chǎn)生愈傷組織的最適宜培養(yǎng)基：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L、MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。在低濃度的6-BA和KT培養(yǎng)基中，叉葉茅膏菜雖然能產(chǎn)生愈傷組織，但時(shí)間較長(zhǎng)，誘導(dǎo)率較低；在高濃度的6-BA和KT培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)愈傷組織的效率較高，但是愈傷組織的狀態(tài)為顆粒狀且顏色為紫紅色，不利于下一步愈傷組織的分化。

研究不同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度對(duì)叉葉茅膏菜愈傷組織分化的影響，6-BA、KT、ZT、TDZ都能誘導(dǎo)愈傷組織分化，在相同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作用下，以ZT的效果最好，分化出的芽較健壯；在高濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作用下，分化出的芽呈黃綠色或黃色，尤其當(dāng)TDZ 1.0 mg/L時(shí)，分化出的芽還出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，因此，適于叉葉茅膏菜愈傷組織分化的培養(yǎng)基為MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

4 結(jié)論

綜上所述，對(duì)于叉葉茅膏菜最佳組培快繁體系的建立，最佳消毒處理方式：75%酒精30 s+0.15%氯化汞8 min+0.5%次氯酸混合液15 min；愈傷組織誘導(dǎo)的最適宜培養(yǎng)基：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L、MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；愈傷組織分化的適宜培養(yǎng)基：MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L。