LAMP的發(fā)展及在口蹄疫診斷中的應(yīng)用

侯 謙，代軍飛，張 杰

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046)

1 LAMP技術(shù)簡介

1.1 LAMP背景

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification method, LAMP)是一門新興的基因擴(kuò)增技術(shù)，由日本學(xué)者Notomi于2000年在《Nucleic Acids Res》雜志上公開發(fā)表。自建立以來，隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展，已成功地應(yīng)用于多種病原微生物、胚胎以及食品生物安全等方面的檢測。它與經(jīng)典傳統(tǒng)的核酸診斷方法PCR、qPCR相比具有更高或相似的靈敏度，比PCR可高10倍或者更多；反應(yīng)時(shí)間比PCR縮短至30～60 min；無需要特殊儀器；操作簡單，核酸(DNA或RNA)檢測只需如PCR一樣的混合反應(yīng)體系，完成后可肉眼觀察結(jié)果[1]。

1.2 LAMP反應(yīng)原理

LAMP反應(yīng)是根據(jù)靶基因的6個不同區(qū)域設(shè)計(jì)對應(yīng)的4條引物，分為2條外引物和2條內(nèi)引物。在LAMP反應(yīng)時(shí)，先由3′內(nèi)引物的一部分片段和模板鏈的靶基因區(qū)域結(jié)合，在BstDNA聚合酶的作用下由3′到5′延伸而逐漸合成內(nèi)鏈。然后再由外引物和模板鏈結(jié)合，通過BstDNA聚合酶的鏈置換功能，沿著外引物擴(kuò)增出的新鏈將內(nèi)引物合成的互補(bǔ)鏈置換出來。置換出來的互補(bǔ)鏈成為下一次擴(kuò)增的模板，重復(fù)上面的過程，另一端的內(nèi)引物也是一部分與互補(bǔ)鏈相互結(jié)合，擴(kuò)增。再由外引物結(jié)合、擴(kuò)增、置換。這樣一個循環(huán)結(jié)束就可以形成LAMP反應(yīng)的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)——莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，然后接下來的擴(kuò)增循環(huán)則在基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)之上由2條內(nèi)引物參與循環(huán)，反應(yīng)得到的最終產(chǎn)物是長短不一的DNA莖環(huán)狀片段混合物[2]。

1.3 LAMP產(chǎn)物檢測

由上述LAMP反應(yīng)原理可知，LAMP的最終產(chǎn)物是一系列不同個數(shù)的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)DNA混合物。且LAMP的反應(yīng)產(chǎn)物也是核酸產(chǎn)物。因此，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物可以使用電泳和凝膠成像系統(tǒng)來檢測。在成像系統(tǒng)中反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)出典型的梯狀條帶，可根據(jù)電泳條帶的有無、形狀、明暗來判斷反應(yīng)結(jié)果。LAMP擴(kuò)增核酸時(shí)會從dNTPs中析出大量副產(chǎn)物——焦磷酸根離子,它們能與反應(yīng)液中的二價(jià)鎂離子結(jié)合,生成白色的焦磷酸鎂沉淀。沉淀可以通過肉眼直接觀察到,以有無乳白色渾濁出現(xiàn)來判斷擴(kuò)增反應(yīng)是否進(jìn)行的方法稱為濁度觀察法。對于濁度觀察法來說，有著核酸擴(kuò)增副產(chǎn)物白色的焦磷酸鎂沉淀只有足量產(chǎn)生時(shí)才易被肉眼觀察到，而沉淀較少時(shí)肉眼易產(chǎn)生誤差而觀察不到沉淀的缺點(diǎn)。由此，實(shí)時(shí)濁度儀的產(chǎn)生為實(shí)時(shí)觀察反應(yīng)各時(shí)刻的沉淀產(chǎn)生情況提供了條件。此外科研工作者通過嘗試添加顯色劑的方法來擴(kuò)大結(jié)果肉眼可見的優(yōu)勢——一種最適用于基層臨床檢測的判斷方法。根據(jù)LAMP陽性反應(yīng)前后有顯著顏色變化來判斷結(jié)果，避免了濁度觀察法的缺點(diǎn)。一般常見的顯色劑有鈣黃綠素(Calcein)、根據(jù)反應(yīng)液中pH值變化而變色的羥基萘酚藍(lán)(Hydroxy naphthol blue，HNB)和結(jié)合到DNA雙鏈結(jié)構(gòu)小溝中的SYBR Green 1核酸染料[3-4]。

2 LAMP的發(fā)展及應(yīng)用

LAMP因其簡單、便捷等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，但單一的目標(biāo)物檢測已經(jīng)不能滿足實(shí)際的需求。因此，多重LAMP檢測技術(shù)也隨之發(fā)展起來，即在同一反應(yīng)體系中同時(shí)檢測多個目標(biāo)基因，快速提高了目標(biāo)物的檢測效率。根據(jù)林文慧等[5]報(bào)道了多重LAMP檢測技術(shù)可以分為狹義多重LAMP和廣義多重LAMP。狹義多重LAMP檢測技術(shù)以多種引物為基礎(chǔ)，旨在混合體系中檢測出多種病原等目標(biāo)物。如劉寧偉等針對沙門氏菌的bcfD基因、副溶血弧菌的tlh基因以及單核細(xì)胞增生性李斯特菌的iap基因建立了可以同時(shí)檢測這3種細(xì)菌的多重LAMP方法[6]。多重LAMP技術(shù)還可以與其他技術(shù)連用如實(shí)時(shí)熒光檢測以及ELISA方法。研究人員將與dNTP底物可以特異結(jié)合的靶基因探針固定在酶標(biāo)板上，LAMP反應(yīng)后的產(chǎn)物就可以進(jìn)行ELISA步驟，但此方法存在操作較為耗時(shí)的缺點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光的檢測通過監(jiān)測反應(yīng)過程中的熒光信號強(qiáng)度來判斷結(jié)果，不僅可以避免LAMP反應(yīng)開管、產(chǎn)物凝膠電泳等過程，而且可以對目標(biāo)基因進(jìn)行定量檢測和分析。如田浩等[7]建立了多重?zé)晒釲AMP法檢測食源性致病菌金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，相對qPCR檢測靈敏度103CFU/mL，其檢測靈敏度達(dá)到了71 CFU/mL。Kouguchi等在LAMP體系中加入帶有FAM熒光基團(tuán)標(biāo)記的一條引物(另一條則沒有)和溴化乙錠嵌合染料，通過帶FAM引物熒光信號和溴化乙錠染料之間信號強(qiáng)度的改變，實(shí)現(xiàn)了快速且準(zhǔn)確實(shí)時(shí)檢測2個大腸桿菌毒素基因的擴(kuò)增。其成本低于雙探針qPCR,但此法在靈敏性和普遍適用性上還需要改進(jìn)，如在體系優(yōu)化和結(jié)果解析上也有一定的困難[8]。廣義多重LAMP技術(shù)避開了狹義多重LAMP技術(shù)的多組引物之間的相互干擾和競爭，將核酸檢測等生化分析的一系列過程縮小到極小的芯片或者毛細(xì)管上，以達(dá)到減少人工污染等問題，提高檢測效率。Fang等[9]在2010年發(fā)表論文報(bào)道了他們設(shè)計(jì)了一種多重LAMP檢測芯片，能夠同時(shí)進(jìn)行8個擴(kuò)增反應(yīng)。

LAMP最開始因引物設(shè)計(jì)長度需要的原因，無法檢測小于100 bp的核酸片段。但Marciniak等[10]將LAMP擴(kuò)增技術(shù)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)成功結(jié)合使得核酸短片段31 bp的檢測成為可能。另外LAMP引物設(shè)計(jì)也得到了發(fā)展，以前是4條引物對應(yīng)靶基因的6個不同區(qū)域，現(xiàn)在是6條引物對應(yīng)靶基因的8個不同區(qū)域，擴(kuò)大了引物設(shè)計(jì)選擇區(qū)域。且由6條引物的LOOP-LAMP過渡到了STEM-LAMP方法，解決了LOOP-LAMP引物設(shè)計(jì)的局限性，增加了反應(yīng)的多重性，以及定量定性的檢測[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，近年來，LAMP方法已被廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測，包括細(xì)菌、病毒、支原體和寄生蟲等；也應(yīng)用于不同物種性別和胚胎性別以及食品安全、基因芯片等方面的快速檢測[11]。LAMP的高敏感性也使得其檢測樣品多樣，2008年，Kelly等在人類免疫缺陷型病毒(HIV)上運(yùn)用了LAMP檢測技術(shù)，檢測病毒感染者的血漿和血液，而不是核酸提取物。靈敏度可達(dá)每管10拷貝，35 min內(nèi)可完成擴(kuò)增反應(yīng)，大大縮短了病毒的檢測時(shí)間[12]。Park等使用LAMP檢測豬圓環(huán)病毒3(Porcine circovirus 3, PCV3)的衣殼基因，向反應(yīng)體系中添加HNB顯色劑顯示陽性。62 ℃、40 min可完成檢測，檢測限度為50個拷貝低于常規(guī)PCR的拷貝，與PCV3的qPCR反應(yīng)相當(dāng)。通過臨床樣品檢測結(jié)果表明，PCV3的LAMP檢出率高于PCR，與qPCR一致13]。Arfaatabar等[14]在2019年報(bào)道將LAMP用于臨床支原體的檢測，采集患病者的咽拭子樣本。在110個樣本中，35個樣本中檢測為陽性。此外，未與其他細(xì)菌的基因組DNA出現(xiàn)交叉反應(yīng)。比培養(yǎng)方法高10個陽性樣本的檢出，且確定了LAMP測定的檢測限為33 fg/μL。與PCR相比，LAMP測定的特異性和靈敏度分別為92.5%、100.0%。

PCR可以鑒定鳥類性別但需要特殊的設(shè)施，無法在戶外應(yīng)用。Centeno-Cuadros等研究人員為解決現(xiàn)場和快速了解鳥類個體性別的問題，提出了一種基于重復(fù)的性染色體特異基因解旋酶DNA結(jié)合蛋白擴(kuò)增的室外鳥類性別LAMP測定技術(shù)。在獅鷲、埃及禿鷹和黑鳶上測試了此方法。成功地跨物種應(yīng)用于3個不同的猛禽亞科，為其他猛禽亞科的分子性別鑒定提供了一個有應(yīng)用前景的檢測技術(shù)[15]。

Mohammad等在文章中提到人類基因中Y染色體的性別決定區(qū)基因(sex-determining region of the Y chromosome，SRY)能決定成為男性還是女性，在正常男性甚至性染色體為XX的男性中都有發(fā)現(xiàn)，而女性基因中沒有。Mohammad等利用LAMP技術(shù)鑒定SRY基因，用于妊娠期人類胚胎性別鑒定。收集妊娠8周孕婦15份血漿DNA，LAMP結(jié)果表明：男性胚胎7份(46.6%)，女性胚胎8份(53.4%)[16]。

3 口蹄疫的流行現(xiàn)狀

口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)是一種偶蹄動物易發(fā)的急性、熱性、高度接觸性傳染水泡疾病，其易感動物達(dá)70多種，偶見于人和其他動物。其臨診特征為口腔粘膜、蹄部和乳房皮膚發(fā)生水皰，由口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)引起[17]?？谔阋叱Ｔ诖憾竟?jié)集中發(fā)病，極易造成大面積的流行，雖然病死率低，但是發(fā)病率高，一旦暴發(fā)此病就會給當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)以及進(jìn)出口貿(mào)易帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，世界動物衛(wèi)生組織的2/3成員國受到了口蹄疫的感染，且給沒有口蹄疫的國家生物安全帶來了嚴(yán)重威脅[18]。每年由口蹄疫造成的可見的產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)損失和在流行區(qū)域進(jìn)行疫苗防控所花費(fèi)估計(jì)為65億～210億美元，而暴發(fā)口蹄疫的國家則每年損失超過15億美元[19]。在印度由FMD造成的直接經(jīng)濟(jì)損失每年可以達(dá)到44.5億美元。而且由口蹄疫自由國家施加的貿(mào)易壁壘造成的經(jīng)濟(jì)損失可能更多[20]。

關(guān)于口蹄疫最早的相關(guān)消息是發(fā)生于1514年意大利威尼斯關(guān)于牛的描述。到現(xiàn)在已經(jīng)有500多年的歷史了，F(xiàn)MD幾乎存在于全世界范圍飼養(yǎng)偶蹄動物的一百多個國家。發(fā)達(dá)國家多半已經(jīng)消除了FMD，多分布于發(fā)展中國家。但是口蹄疫的范圍卻經(jīng)常發(fā)生變化，2012年SAT-2 FMD在非洲北部和中東地區(qū)暴發(fā)引起了巨大的損失和國際的危機(jī)。2014年O型FMDV在非洲北部的未流行區(qū)域的暴發(fā)，引發(fā)了大家的廣泛關(guān)注。此外在南非地區(qū)，持續(xù)的FMD暴發(fā)拖慢了要長期建立FMD的控制項(xiàng)目的步伐[21]。而亞洲地區(qū)常有外來血清型的出現(xiàn)，比如2015年，一種從未在印度國家出現(xiàn)的血清型為A型的譜系的FMDV在這個國家的展露導(dǎo)致了許多疫病暴發(fā)，其傳播路徑為從中東和土耳其發(fā)展而來。以及我國廣東地區(qū)2013年出現(xiàn)的A型Sea-97/G2,其來源是位于亞洲大陸的東南亞地區(qū)[22]，其他地區(qū)如歐洲國家和俄羅斯等地區(qū)也有見此病毒的報(bào)道?？傮w上說FMDV的暴發(fā)形式為在部分區(qū)域流行、范圍寬廣。對于我國來說，從2005年到2014年這十年間，已經(jīng)向OIE報(bào)道FMDV的發(fā)生達(dá)到115次。其中群1中的C型FMDV最后一例在2005年于埃塞俄比亞發(fā)生，故我國目前不再存在C型口蹄疫。我國主要流行的FMDV為O型、A型和Asia 1型等3個血清型。在這10年間，O型FMD暴發(fā)38次、A型FMD暴發(fā)31次、Asia 1型FMD暴發(fā)46次，但Asia 1型均發(fā)生于2009年以前[23]。這些疫病的暴發(fā)多為境外外來毒株的傳播，如2010年于我國廣東省暴發(fā)的O型Mya-98和2013年的A型Sea-97/G2，其起源均為亞洲的東南亞地區(qū)。貴州地區(qū)于2011年出現(xiàn)的PanAsia毒株則來源于南亞地區(qū)。在2017年起源是印度大陸FMDV O/ME-SA/Ind2001系毒株，在我國新疆省首次被發(fā)現(xiàn)命名為O/XJ/CHA/2017[24]。此外南非型口蹄疫大多局限于非洲地區(qū)的撒哈拉沙漠以南區(qū)域。不同的血清型分布區(qū)域有所差異，其中SAT3血清型分布較其他2種南非型廣泛。但是發(fā)病率最高的卻為SAT2-FMDV。最近隨著全球的經(jīng)濟(jì)貿(mào)易和進(jìn)出口的發(fā)展。SAT2-FMDV已經(jīng)從非洲地區(qū)擴(kuò)散到巴基斯坦，由于中國西南部與巴基斯坦毗連存在著南非型口蹄疫從巴基斯坦傳播到我國的風(fēng)險(xiǎn)。因此防控局勢較為嚴(yán)峻[21]。

4 LAMP在口蹄疫診斷中的應(yīng)用

因口蹄疫病毒的重要性，它的診斷方式在家畜疾病領(lǐng)域一直被作為重點(diǎn)研究的對象，隨著口蹄疫的不斷發(fā)展，其診斷方式也不斷豐富起來。歸結(jié)起來主要分為3大類：一類是血清學(xué)檢測——根據(jù)抗原抗體以及補(bǔ)體之間的特殊結(jié)合作用來檢測病原，包括病毒中和試驗(yàn)(Virus neutralization test，VNT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(Complement Fixation Test,CFT)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(Agar Gel Immunodiffusion,AGID)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)[25]。一類是病原分離——被OIE確定為病原確診的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。主要通過細(xì)胞的培養(yǎng)和動物接種，觀察接種之后細(xì)胞是否會出現(xiàn)相應(yīng)的生長狀態(tài)或者相應(yīng)的細(xì)胞病變以及動物接種之后會出現(xiàn)同樣的臨床癥狀。最后一類是分子生物學(xué)檢測——利用引物，對FMDV基因某些特定的片段等進(jìn)行擴(kuò)增，然后再進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)或者當(dāng)場就可以確認(rèn)結(jié)果，包括RT-qPCR、PCR和LAMP等檢測方法。血清學(xué)檢測中ELISA方法被研究得最多，我國已有Asia 1、O和A型固相競爭ELISA抗體檢測方法；非結(jié)構(gòu)蛋白抗體特異性單抗阻斷ELISA，檢測3ABC蛋白ELSIA以區(qū)分野毒感染和疫苗毒免疫等多種各異的ELISA檢測方法[26]。病原分離方法主要應(yīng)用于幼地鼠腎細(xì)胞系和豬腎細(xì)胞系，其檢測靈敏度高但耗時(shí)較長。分子生物學(xué)檢測的qPCR中設(shè)計(jì)特異性引物，制作成試劑盒，通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測，可以有效、準(zhǔn)確地區(qū)分A、O和Asia 1等多個血清型的口蹄疫病毒。LAMP檢測技術(shù)也應(yīng)用于了口蹄疫病毒的鑒定。2008年泰智鋒[27]和2009年李健[28]等分別報(bào)道了口蹄疫病毒的RT-LAMP檢測方法的建立。泰智鋒等[27]針對口蹄疫病毒的O、A、C和Asia 1這4種血清型的3D區(qū)域設(shè)計(jì)了6條引物，陳沁則收集了232株不同血清型的口蹄疫病毒株核苷酸序列信息利用相關(guān)網(wǎng)站設(shè)計(jì)了LAMP的引物。泰智鋒等[27]的LAMP檢測結(jié)果是在反應(yīng)結(jié)束后向體系中加入SYBR Green 1染料，在紫外燈照射下觀察是否有綠色熒光的產(chǎn)生。李健等[28]則是對比了核酸凝膠電泳法、沉淀觀察法和Picogreen綠色熒光法3種不同方法，最后證實(shí)Picogreen熒光檢測法是這3種檢測方法中最為簡便、可靠的一種。隨后范晴等[29-30]先后建立了口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒二重RT-LAMP鑒別檢測方法和口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒二重?zé)晒釸T-LAMP方法鑒別檢測方法，能同時(shí)鑒別口蹄疫病毒的A、O、Asia 1等亞型和水泡性口炎的新澤西型和印第安亞型。前者在內(nèi)引物之間插入了EcoRⅠ酶切位點(diǎn),反應(yīng)之后通過酶切回收的基因片段測序，確定擴(kuò)增的核酸片段為目的基因。后者在內(nèi)引物5′加上標(biāo)記的熒光基團(tuán)，通過不同熒光通道顯示不同的顏色。對比而言，后者更比前者具有成本少、時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)。韓國的Lim等[31-32]分別開發(fā)并評估了基于引物的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(sRT-LAMP)檢測血清型O型、A型FMDV的敏感和特異性。這2個實(shí)驗(yàn)特異性擴(kuò)增了O型FMDV的VP3基因和A型FMDV的Sea-97基因型的VP1基因。檢測的檢測限都為102TCID50/mL，比RT-PCR靈敏10倍，與qRT-PCR的靈敏度相當(dāng)。與其他病原沒有陽性反應(yīng)。此外分子檢測和微流體技術(shù)的發(fā)展為快速檢測動物病毒方面開辟了新的途徑。Yuan等通過整合LAMP檢測技術(shù)和微流控芯片技術(shù)——離心微流體盤(CMFD)，62 ℃、60 min內(nèi)可成功檢測包括口蹄疫病毒在內(nèi)的多種病毒。其靈敏度與每個反應(yīng)1×102個拷貝的管型LAMP濁度法相當(dāng)。Yuan等研究發(fā)現(xiàn)CMFD在檢測口蹄疫病毒等目標(biāo)方面具有高度特異性，與豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒等沒有交叉反應(yīng)。利用CMFD對6種豬病毒臨床樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：CMFD比傳統(tǒng)PCR檢測混合病毒感染更敏感陽性檢出率為44.0%。分子檢測和微流控芯片技術(shù)的結(jié)合運(yùn)用為檢測病原體提供快速、可靠的檢測方法，特別是多種混合感染臨床樣本中的病毒的檢測[33]。