用高倍顯微鏡觀察葉綠體和線粒體實(shí)驗(yàn)的探索與改進(jìn)

王桔紅，張燕芳，林曉娃

（1.韓山師范學(xué)院 食品工程與生物科技學(xué)院，廣東 潮州 521041；2.澄海中學(xué)，廣東 汕頭 515800）

人教版生物學(xué)高中必修一《分子與細(xì)胞》的第3章第2節(jié)“用高倍顯微鏡觀察葉綠體和線粒體”是一個(gè)觀察驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)［1］，目的是讓學(xué)生認(rèn)識(shí)葉綠體和線粒體的形態(tài)和分布，增加感性認(rèn)識(shí)，同時(shí)學(xué)習(xí)在光學(xué)顯微鏡下觀察葉綠體和線粒體的方法和技巧.教材中提供觀察葉綠體的材料是蘚類、菠菜和黑藻.然而，受到地域和季節(jié)的限制［2］，部分地區(qū)很難找到新鮮蘚類和黑藻［3］，實(shí)驗(yàn)材料的不足或缺失制約了實(shí)驗(yàn)的正常開展以及實(shí)驗(yàn)效果的達(dá)成.觀察線粒體實(shí)驗(yàn)中，有較多的干擾因素，如用消毒牙簽刮取口腔黏膜時(shí)易摻雜其他物質(zhì)；健那綠溶解度低，不易溶解或易形成染液顆粒；健那綠染液濃度過高，細(xì)胞會(huì)失去活性等.因此，取材技巧、染液配制方法及染液濃度是影響觀察線粒體實(shí)驗(yàn)效果的重要因素［4］.

為了更清晰地觀察到葉綠體和線粒體的形態(tài)和分布，本研究除了葫蘆蘚（Funaria hygrometrica）外，選取了8種野生植物和10種蔬菜作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)“觀察葉綠體”的實(shí)驗(yàn)材料和取材方法進(jìn)行了探索，以找到更合適的替代材料；同時(shí)探索了觀察口腔上皮細(xì)胞線粒體的染液濃度和染色方法，嘗試用植物細(xì)胞觀察線粒體，并提出相關(guān)建議.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)選取觀察葉綠體實(shí)驗(yàn)的植物包括葫蘆蘚、8種野生植物和10種常見市售蔬菜（表1）.8種野生植物包括野菊（Dendranthema indicum）、小飛蓬（Conyza canadensis）、黃鵪菜（Youngia Japonica）、鬼針草（Bidens pilosa）、魚腥草（Houttuynia cordata）、車前（Plantago asiatica）、蘇丹鳳仙花（Impatiens walleriana）、長壽花（Kalanchoe blossfeldiana）；10 種蔬菜包括油麥菜（Lactuca sp.）、春菜（Lactuca sp.）、上海青（Brassica chinensis）、菜心（B. campestris）、白菜（B. pekinensis）、空心菜（Ipomoea aquatic）、蔥（Allium fistulosum）、蒜苗（A.sativum）、韭菜（A. tuberosum）、菠菜（Spinacia oleracea）.選取白菜［4］、蔥［5-6］、蒜苗、洋蔥［6］、酵母菌（Yeast）［1］以及口腔上皮細(xì)胞作為線粒體的顯微觀察材料.

表1 觀察葉綠體的植物

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

葫蘆蘚的葉片是單層細(xì)胞，取一片葉即可直接觀察到清晰的葉綠體.其他植物材料則需挑選綠色葉片、洗凈，將葉片置于清水中，防止葉片萎蔫而導(dǎo)致下表皮與葉肉結(jié)合過多，有利于觀察；沿與葉脈垂直方向撕?。礄M向撕?。┲参锶~片下表皮，獲得下表皮以及部分葉肉細(xì)胞；將撕下的下表皮置于帶有1～2滴清水的載玻片上，用鑷子傾斜輕輕按壓表皮排出部分氣泡，再蓋上蓋玻片，靜置3～5分鐘（以減少氣泡），置于光學(xué)顯微鏡下由低倍至高倍逐漸觀察.

在觀察線粒體實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%和0.6%健那綠染液分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和效果比較；配制健那綠染液時(shí)，加溫到30～40 ℃，使其充分溶解；采用引流法進(jìn)行染色［7］，置于光學(xué)顯微鏡下由低倍至高倍逐漸觀察.

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體的觀察結(jié)果

（1）從撕取植物下表皮難易程度看，十字花科的菜心和上海青最容易撕取稍有葉肉細(xì)胞的表皮，其次是長壽花、蘇丹鳳仙花、野菊、小飛蓬、黃鵪菜、鬼針草、春菜、油麥菜以及魚腥草.

圖1 葫蘆蘚葉顯微照片

（2）從葉肉細(xì)胞葉綠體清晰度看，用成熟的葫蘆蘚作為實(shí)驗(yàn)材料，沒有氣孔、干擾少、葉綠體大而清晰，觀察效果最佳（圖1）.其他植物觀察效果依次是：野菊＞魚腥草＞小飛蓬＞油麥菜＞春菜＞黃鵪菜＞鬼針草＞上海青、菜心、白菜＞蔥、洋蔥、蒜苗、韭菜＞空心菜＞菠菜＞車前草＞長壽花＞蘇丹鳳仙花（圖2～8）.

（3）從保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體的清晰度看，長壽花、春菜、小飛蓬、油麥菜、白菜以及魚腥草的保衛(wèi)細(xì)胞里可清晰觀察到較大的葉綠體（圖9～14），韭菜、蘇丹鳳仙花、鬼針草、上海青的保衛(wèi)細(xì)胞里的葉綠體相對(duì)較小.值得一提的是，油麥菜的表皮細(xì)胞也可觀察到葉綠體（圖4），韭菜、長壽花、春菜、小飛蓬的表皮細(xì)胞和保衛(wèi)細(xì)胞均可觀察到清晰的葉綠體.

（4）在白菜、魚腥草的表皮細(xì)胞以及空心菜的葉肉細(xì)胞中觀察到了細(xì)胞質(zhì)流動(dòng).

圖2 野菊葉片下表皮及葉肉細(xì)胞

圖3 小飛蓬葉下表皮及葉肉細(xì)胞

圖4 油麥菜葉下表皮及葉肉細(xì)胞

圖5 菜心下表皮及葉肉細(xì)胞

圖6 蒜苗下表皮及葉肉細(xì)胞

圖7 魚腥草下表皮及葉肉細(xì)胞

2.2 線粒體的觀察結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)嘗試用白菜、蔥、蒜苗、洋蔥、酵母菌以及口腔上皮細(xì)胞等進(jìn)行線粒體的顯微觀察.結(jié)果顯示，動(dòng)物細(xì)胞（口腔上皮細(xì)胞）的線粒體容易染色，且線粒體大，觀察效果最佳（圖15）；其次，在蔥和洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞中也可觀察到較清晰的線粒體（圖16）；在白菜和蒜苗的內(nèi)表皮細(xì)胞中，能觀察到細(xì)小的線粒體，但分辨效果較差；以酵母菌為材料觀察線粒體時(shí)，線粒體小且較難觀察到，故不宜作為實(shí)驗(yàn)材料.

圖8 菠菜下表皮及葉肉細(xì)胞

圖9 小飛蓬保衛(wèi)細(xì)胞（10×100）

圖10 春菜保衛(wèi)細(xì)胞（10×100）

圖11 油麥菜保衛(wèi)細(xì)胞（10×100）

圖12 白菜保衛(wèi)細(xì)胞（10×100）

圖13 長壽花保衛(wèi)細(xì)胞（10×100）

圖14 蘇丹鳳仙花保衛(wèi)細(xì)胞（10×100）

圖15 口腔上皮細(xì)胞（10×100）

圖16 蔥內(nèi)表皮細(xì)胞（10×100）

3 討論

生物學(xué)是一門以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的自然科學(xué)，現(xiàn)代生物科學(xué)的發(fā)展尤其依賴于科學(xué)實(shí)驗(yàn).中學(xué)生物實(shí)驗(yàn)對(duì)于學(xué)生掌握生物學(xué)知識(shí)、理解科學(xué)研究過程與方法以及核心素養(yǎng)的培養(yǎng)有至關(guān)重要的作用.“用高倍顯微鏡觀察葉綠體和線粒體”是一個(gè)觀察驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，教材提供了蘚類、菠菜和黑藻的葉作為觀察葉綠體的材料，然而由于我國南北自然地理和氣候條件差異較大，實(shí)驗(yàn)材料不易獲取，選擇方便易取而且觀察效果最佳的實(shí)驗(yàn)材料是觀察葉綠體實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵.此外，受觀察材料、方法以及染液配制等因素影響，觀察線粒體的實(shí)驗(yàn)效果也不盡如人意.

本研究選取了8種野生植物和10種蔬菜為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)“觀察葉綠體”的實(shí)驗(yàn)材料、取材方法進(jìn)行了探索.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除教材中提供的實(shí)驗(yàn)材料外，一些常見野生植物和蔬菜也可作為較好的葉綠體觀察材料.其中菜心和上海青以及長壽花、蘇丹鳳仙花、野菊、小飛蓬、黃鵪菜、鬼針草最易撕取帶有少許葉肉細(xì)胞的表皮；野菊、魚腥草、小飛蓬、油麥菜、春菜等植物下表皮的葉綠體大且清晰；長壽花、春菜、小飛蓬、油麥菜、大白菜以及魚腥草的保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體清晰可見，均可作為“觀察葉綠體”的最佳實(shí)驗(yàn)材料.綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在“觀察葉綠體”實(shí)驗(yàn)中優(yōu)先選擇成熟的蘚類植物，其次是菊科植物和十字花科植物，這3類植物葉綠體更大，且取材容易，觀察效果最佳.此外，白菜和魚腥草的表皮細(xì)胞以及空心菜的葉肉細(xì)胞中均可觀察到細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)，可將“觀察葉綠體”和“觀察細(xì)胞質(zhì)的流動(dòng)”這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)合并開展［8］.

在“觀察葉綠體”實(shí)驗(yàn)中，需注意以下幾點(diǎn)：1）宜選擇草本植物作為材料，因?yàn)楣嗄尽棠局参锏娜~多革質(zhì)化，較難撕出稍帶葉肉細(xì)胞的表皮；2）宜選擇葉脈較疏松的植物，更容易撕出一大片表皮；3）盡量選擇老幼適中的葉片.因?yàn)槔先~較革質(zhì)化，不易撕，而嫩葉的葉綠體發(fā)育不完整，不易觀察；4）一般選擇綠色而沒有其他顏色干擾的葉片；5）臨時(shí)裝片中的材料應(yīng)保持有水狀態(tài)，以保證葉綠體的正常形態(tài)并能懸浮在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，否則細(xì)胞失水收縮，影響其形態(tài)的觀察.

“觀察線粒體”實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，植物細(xì)胞中線粒體較小且分散，較難觀察到，不宜作為觀察材料，因而最佳的觀察線粒體實(shí)驗(yàn)材料仍是口腔上皮細(xì)胞.健那綠是專一性線粒體的活細(xì)胞染料，通過對(duì)活細(xì)胞染色，可使線粒體呈現(xiàn)藍(lán)綠色，而細(xì)胞質(zhì)接近無色，以便在高倍顯微鏡下觀察到線粒體分布和形態(tài).然而，健那綠染液濃度不宜過高，否則可導(dǎo)致細(xì)胞失活；染液配制中健那綠應(yīng)充分溶解，否則會(huì)出現(xiàn)較多染液顆粒，影響觀察效果.本實(shí)驗(yàn)顯示，將健那綠染液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由1%降低至0.6%，并采用引流法［8］，可以避免染色過深以及健那綠顆粒等雜物干擾，效果更佳.此外，由于線粒體較小，應(yīng)使用油鏡觀察.

本研究在“觀察葉綠體”的實(shí)驗(yàn)中探索了多種簡(jiǎn)單易取的實(shí)驗(yàn)材料以及取材技巧，不僅可以觀察到葉肉細(xì)胞的葉綠體，還可以觀察到保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體，使學(xué)生更加清楚和理解葉綠體形態(tài)和分布狀況.觀察葉綠體可選用的材料其實(shí)很多，教師可結(jié)合本文提供的材料和取材方法，根據(jù)當(dāng)?shù)貙?shí)際情況選取適當(dāng)?shù)牟牧?；同時(shí)，可鼓勵(lì)學(xué)生自帶實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行觀察葉綠體實(shí)驗(yàn)的嘗試和探索，激發(fā)學(xué)生探究生物奧秘的興趣和熱情.對(duì)于線粒體的觀察實(shí)驗(yàn)，未來應(yīng)進(jìn)一步探索除了口腔上皮細(xì)胞，還有哪些動(dòng)物細(xì)胞的線粒體易于觀察且取材容易，以找到更合適的實(shí)驗(yàn)材料，為中學(xué)生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供參考.