畜禽糞便堆肥高溫保氮菌Aliibacillus thermotolerans BM62的篩選及復(fù)壯

高君峰，徐 杰，王澤懿，劉文越，狄魯濱，張勝美，陳 舒，?？肾?/p>

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

畜禽糞便堆肥高溫期氨揮發(fā)嚴(yán)重，導(dǎo)致堆肥中氮損失并造成環(huán)境污染［1-3］。將NH3轉(zhuǎn)化為控制氨揮發(fā)一直是堆肥研究的熱點(diǎn)。氨氧化細(xì)菌是堆肥中將NH3轉(zhuǎn)化為N的關(guān)鍵微生物，但其大多數(shù)為中溫菌，只能在降溫期發(fā)揮作用。而且，其難培養(yǎng)特性導(dǎo)致很少純種被分離純化，限制了其個(gè)體生理代謝的研究。針對(duì)此問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)篩選到一株高溫微好氧氨氧化細(xì)菌，經(jīng)鑒定此菌株為芽孢桿菌科（Bacillaceae）的一個(gè)新屬，命名為Aliibacillus thermotolerans BM62。

菌種在長(zhǎng)期的保藏過(guò)程中必然會(huì)受外界因素或自發(fā)突變的影響，導(dǎo)致其某些優(yōu)良性能不同程度的衰退［4］。不可避免的菌種退化會(huì)嚴(yán)重影響菌種的特性和質(zhì)量，從而對(duì)相關(guān)的理論研究和實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用帶來(lái)嚴(yán)重阻礙或經(jīng)濟(jì)損失。因此合適有效的復(fù)壯措施研究一直是菌種資源保藏和利用過(guò)程中的必要工作［5］。相關(guān)研究表明，氨氧化細(xì)菌由于反復(fù)迭代等原因，其氨氧化能力衰退明顯［6］。而且，由于氨氧化細(xì)菌自身具有生長(zhǎng)速率低、世代周期長(zhǎng)、其培養(yǎng)物易受異養(yǎng)菌感染而不易分離純化等原因，目前為止獲得的氨氧化細(xì)菌純培養(yǎng)種類極少［7-9］，導(dǎo)致有關(guān)氨氧化細(xì)菌，尤其是高溫異養(yǎng)氨氧化細(xì)菌的菌種復(fù)壯技術(shù)鮮有報(bào)道。針對(duì)于此，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)提供此株高溫微好氧氨氧化細(xì)菌Aliibacillus thermotolerans BM62的復(fù)壯方法，為畜禽糞便堆肥的保氮處理提供持續(xù)的微生物源。

1 材料與方法

1.1 篩菌堆肥實(shí)施及篩菌過(guò)程

1.1.1 篩菌樣品堆肥實(shí)施

堆肥原料為牛糞和水稻秸稈，分別取自哈爾濱香坊區(qū)幸福鄉(xiāng)和香坊農(nóng)場(chǎng)。干燥的水稻秸稈剪成1～2 cm長(zhǎng)的小段，與牛糞按照1∶3.5的質(zhì)量比（干重）混合均勻。堆肥中總C/N質(zhì)量比約為30∶1，水分含量約為65%。堆肥發(fā)酵堆規(guī)格為1.5 m（長(zhǎng)）×1.5 m（寬）×1.2 m（高）。在不同堆肥（溫度）時(shí)期取樣，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 氨氧化菌BM62的篩選過(guò)程

從4個(gè)不同溫度（45、50、58、65℃）的堆肥樣品中分別稱取5 g樣品，分別置于裝有45 mL的無(wú)菌水100 mL的錐形瓶中振蕩30 min制成菌懸液。將菌懸液分別抽取10 mL分別置于裝有150 mL富集培養(yǎng)基的錐形瓶中50℃恒溫振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150 r/min。

從培養(yǎng)4 d后的錐形瓶中分別吸取0.5 mL培養(yǎng)菌液采用涂布法分別接種于平皿（劃線分離培養(yǎng)基）中，置于50℃培養(yǎng)箱中微好氧倒置培養(yǎng)7 d。挑取單菌落，采取平板劃線法純化單菌落。

將純化的單菌落接種于裝有10 mL氨氧化細(xì)菌檢測(cè)培養(yǎng)基的試管中振蕩微好氧培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)溫度為50℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min。采用格里斯試劑法進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié)果呈淺粉至深玫瑰紫色變化，表明該菌株具有氨氧化能力；陰性結(jié)果無(wú)顏色變化，表明該菌株無(wú)氨氧化能力。據(jù)此篩選出高溫微好氧氨氧化細(xì)菌株，將菌種接入斜面培養(yǎng)后，移入冰箱4℃條件下保藏。

菌株Aliibacillus thermotolerans BM62分離自58℃堆肥樣品。

1.1.3 本實(shí)驗(yàn)所需復(fù)壯氨氧化菌種Aliibacillus thermotolerans BM62代系為子五代。

1.2 培養(yǎng)基配方

氨氧化菌富集培養(yǎng)基：（NH4）2SO45 g，KCl 4 g，MgSO42.5 g，CaCl21.85 g，NaCl 3 g，NaHCO342 g，蛋白胨30 g，牛肉膏20 g，pH值=8，蒸餾水1 000 mL；

氨氧化菌劃線分離培養(yǎng)基（C-2培養(yǎng)基）［6］：（NH4）2SO45 g，KCl 4 g，MgSO42.5 g，CaCl21.85 g，NaCl 3 g，NaHCO342 g，蛋白胨60 g，牛肉膏 40 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL；

氨氧化細(xì)菌檢測(cè)培養(yǎng)基：（NH4）2SO45 g，KCl 4 g，MgSO42.5 g，CaCl21.85 g，NaCl 3 g，NaHCO37.5 g，蛋白胨 5 g，牛肉膏1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL；

復(fù)壯馴化培養(yǎng)基Ⅰ：稱取堆肥樣品5 g，置于250 mL錐形瓶中加入150 mL蒸餾水制成培養(yǎng)懸液，調(diào)節(jié)pH值=8，3個(gè)平行樣，瓶身分別標(biāo)記A1、A2、A3；

復(fù)壯馴化培養(yǎng)基Ⅱ：稱取堆肥樣品5 g，另加入4 g牛肉膏和6 g蛋白胨，置于250 mL錐形瓶中加入150 mL蒸餾水制成培養(yǎng)懸液，3個(gè)平行樣，瓶身分別標(biāo)記6A1、6A2、6A3；

復(fù)壯馴化培養(yǎng)基Ⅲ：稱取堆肥樣品5 g，另加入8 g牛肉膏和12 g蛋白胨，置于250 mL錐形瓶中加入150 mL蒸餾水制成培養(yǎng)懸液，3個(gè)平行樣，瓶身分別標(biāo)記12A1、12A2、12A3；

氨氧化細(xì)菌種子培養(yǎng)基［6］：（NH4）2SO45 g，KCl 4 g，MgSO42.5 g，CaCl21.85 g，NaCl 3 g，NaHCO342 g，蛋白胨60 g，牛肉膏40 g，pH值=8，蒸餾水1 000 mL；

氨氧化細(xì)菌檢測(cè)培養(yǎng)基［6］：（NH4）2SO45 g，KCl 4 g，MgSO42.5 g，CaCl21.85 g，NaCl 3 g，NaHCO37.5 g，蛋白胨 5 g，牛肉膏1 g，pH值=8，蒸餾水1 000 mL。

1.3 檢測(cè)試劑（格里斯試劑［10］）

A液：對(duì)氨基苯磺酸溶液：稱取4 g對(duì)氨基苯磺酸溶于700 mL水和300 mL冰乙酸中，混勻置于棕色瓶，室溫保存。B液：N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽溶液：稱取N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽加入1 L的60%的乙酸溶液中混勻，置于棕色瓶中，4℃保存，保質(zhì)期為7 d。

檢測(cè)時(shí)加入樣液（培養(yǎng)液）5 mL，格里斯試劑先加A液2 mL充分混勻，再加B液1 mL充分混勻。待測(cè)樣品變?yōu)槊底仙蛎导t色說(shuō)明樣液中菌種的氨氧化能力強(qiáng)；待測(cè)樣品變?yōu)闇\粉色說(shuō)明樣液中菌種的氨氧化能力較強(qiáng)；待測(cè)樣品變?yōu)榈S色說(shuō)明樣液中菌種的氨氧化能力較弱；待測(cè)樣品無(wú)顏色變化說(shuō)明樣液中菌種近乎無(wú)氨氧化能力。

1.4 氨氧化細(xì)菌菌種復(fù)壯

1.4.1 菌株馴化培養(yǎng)

將待復(fù)壯的菌株Aliibacillus thermotolerans BM62（子二代）接種于氨氧化細(xì)菌種子培養(yǎng)基，50℃、100 r/min培養(yǎng)，培養(yǎng)到濃度為D600=0.1～0.15得到種子液，種子液按體積比種子液∶復(fù)壯馴化培養(yǎng)基1∶10接入復(fù)壯馴化培養(yǎng)基中，50℃、100 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)到濃度為D600=0.1～0.15后，取上清菌液按體積比上清菌液∶氨氧化細(xì)菌檢測(cè)培養(yǎng)基1∶10接入氨氧化細(xì)菌檢測(cè)培養(yǎng)基，50℃、100 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)3 d。利用格里斯試劑顯色法進(jìn)行氨氧化能力檢測(cè)。

1.4.2 馴化培養(yǎng)后細(xì)菌的分離純化

（a）平皿涂布培養(yǎng)：取氨氧化能力顯色試驗(yàn)結(jié)果呈玫紅色和玫紫色的復(fù)壯培養(yǎng)菌液，進(jìn)行平皿涂布培養(yǎng)，平皿涂布培養(yǎng)基為氨氧化細(xì)菌固體培養(yǎng)基，50℃恒溫靜止倒置培養(yǎng)5 d；

（b）平皿劃線培養(yǎng)：選取步驟（a）所得平皿涂布培養(yǎng)中菌落長(zhǎng)勢(shì)良好的平皿，挑取獨(dú)立菌落在氨氧化細(xì)菌固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平皿劃線培養(yǎng)，50℃恒溫靜止倒置培養(yǎng)5 d；

（c）單菌落檢測(cè)：?jiǎn)尉鋭澗€平皿中挑選出長(zhǎng)勢(shì)良好的平皿，挑取獨(dú)立菌落接入氨氧化細(xì)菌種子培養(yǎng)基，50℃、100 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)2 d得種子液，調(diào)整種子液濃度為D600=0.1～0.15，按體積比種子液∶氨氧化細(xì)菌檢測(cè)培養(yǎng)基為1∶10接種至氨氧化細(xì)菌檢測(cè)培養(yǎng)基，50℃、100 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，利用格里斯試劑顯色法進(jìn)行單菌落氨氧化能力顯色檢測(cè)。

1.4.3 復(fù)壯有效菌種的氨氧化活性測(cè)定

取單菌落氨氧化能力顯色檢測(cè)結(jié)果呈玫紅色即氨氧化能力強(qiáng)的菌落，將其在步驟1.4.2中（c）得到的種子液按體積比種子液∶氨氧化細(xì)菌種子培養(yǎng)基為1∶10接種至氨氧化細(xì)菌種子培養(yǎng)基，50℃、100 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)2 d后，調(diào)整到濃度為D600=0.1～0.15，按照體積比培養(yǎng)液∶氨氧化細(xì)菌檢測(cè)培養(yǎng)基為1∶10接種至氨氧化細(xì)菌檢測(cè)培養(yǎng)基，50℃、100 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，測(cè)定亞硝酸鹽含量，評(píng)估其氨氧化活性。

氨氧化活性的計(jì)算方法：

亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540 nm處比色。以光密度（OD）為橫坐標(biāo)，亞硝酸根濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定復(fù)壯有效菌株在氨氧化細(xì)菌檢測(cè)培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后540 nm處的吸光度值，根據(jù)亞硝酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出其亞硝酸鈉濃度，用亞硝酸鈉濃度值代表相應(yīng)菌株的氨氧化活性值。

1.5 菌株BM62的鑒定

1.5.1 菌落形態(tài)觀察

將菌株BM62劃線接種于C-2培養(yǎng)基，50℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)。

1.5.2 菌體形態(tài)觀察

利用電子掃描顯微鏡（model CX31-2；Olympus）觀察菌株BM62菌體形態(tài)。

1.5.3 化學(xué)分類分析

菌株BM62的細(xì)胞化學(xué)分析，包括：G+C%含量、脂肪酸成分、極脂組成、呼吸醌類型和肽聚糖的特征氨基酸，以上指標(biāo)均由德國(guó)菌種保藏中心（DSMZ）測(cè)定。

1.5.4 分子鑒定及同源性比較分析

將菌株BM62保藏斜面送至上海生工測(cè)定其16S rDNA序列。將測(cè)得的該菌株的16S rDNA序列利用Blast軟件中的nucleotide blast與GenBank、EMBL及DDBJ等數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，得出菌株BM62與其它相關(guān)的菌株的16S rDNA序列相似性。再用ClustalW2軟件包（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/）進(jìn)行多序列匹配排列。采用MEGA version 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［11］。選擇 最 大 似 然 法（maximum-likelihood）［12］對(duì) 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行估算，通過(guò)1 000次取樣確定其Bootstrap值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株BM62的篩選過(guò)程

從不同溫度的堆肥樣品中共分離純化獲得45株異養(yǎng)氨氧化細(xì)菌，其中12株分離自45℃堆肥樣品，9株分離自50℃堆肥樣品，16株分離自58℃堆肥樣品，8株分離自65℃堆肥樣品。其中分離自58℃堆肥樣品的菌株BM62的氨氧化能力顯色實(shí)驗(yàn)的顏色變化最為明顯，呈深紫色（圖1）。隨后對(duì)菌株BM62進(jìn)行氨氧化能力的定量檢測(cè)，其在氨氧化細(xì)菌檢測(cè)培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h后NO2-濃度為3.81 mg/L，與M é vel等［13］在深海熱泉口分離的一株異養(yǎng)嗜熱氨氧化菌的氨氧化能力相當(dāng)。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)此株嗜熱異養(yǎng)氨氧化細(xì)菌BM62進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定研究。

圖1 菌株BM62的氨氧化能力檢測(cè)顯色

2.2 菌株BM62的鑒別特征

菌株BM62具芽孢，革蘭氏染色陰性，菌體細(xì)胞呈桿狀，長(zhǎng)約2～2.5 μm，寬約0.3～0.6 μm，具鞭毛（圖2）。微好氧，接觸酶陽(yáng)性和氧化酶陰性。該菌株在50℃的生長(zhǎng)和氨氧化能力最強(qiáng)。在C-2培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，菌落直徑擴(kuò)展約為2 mm，菌落呈邊緣整齊的圓形，菌落質(zhì)地濕潤(rùn)、光滑（圖 3）。

16S rRNA分子鑒定結(jié)果顯示，該菌株的16S rRNA序列（登記號(hào)KT999394）與其最近的菌株Alteribacillus persepolensis HS136T的16S rRNA序列相似性僅有94.53%［14］，根據(jù)現(xiàn)有界定新種屬的規(guī)定，16S rRNA序列相似性在90%～95%為新屬［15］，這就表明菌株BM62T很有可能是具有氨氧化能力的新屬細(xì)菌。因此，本實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)對(duì)該菌株做了更加系統(tǒng)詳盡的菌株鑒定試驗(yàn)，主要鑒定結(jié)果如下：G+C（36.5%）；主要脂肪酸為 iso-C16∶0；主要極脂組成為雙磷脂酰甘油（diphosphatidylglycerol）、磷脂（phospholipid）和磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol）；呼吸醌為MK-7（100%）；二氨基庚二酸（meso-diaminopimelic acid）為肽聚糖的特征氨基酸，這些主要的生理生化指標(biāo)均顯示菌株BM62T與其最相近的其他菌株有明顯差異。菌株BM62T與其遺傳關(guān)系最近的3株細(xì)菌的主要性狀比較見(jiàn)表1和表2，BM62T的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖4。據(jù)此，擬將菌株BM62劃分為芽孢桿菌科（Bacillaceae）的新屬，命名為Aliibacillus thermotolerans。該菌株現(xiàn)已保存在DSMZ（德國(guó)）和CGMCC（中國(guó)），保藏號(hào)分別為 DSM 101851T和 CGMCC 1.15790T。

圖2 菌株BM62T菌體透射電鏡照片

圖3 菌株BM62培養(yǎng)5 d后的菌落

表1 菌株BM62與其遺傳關(guān)系最近的3株細(xì)菌的主要性狀比較

表2 菌株BM62與其遺傳關(guān)系最近的3株細(xì)菌的主要脂肪酸組分和含量 （%）

由于對(duì)菌株BM62的研究過(guò)程中需要不斷地反復(fù)迭代，在此過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其氨氧化能力衰退明顯。鑒于該菌株具有難得的高溫氨氧化特性，保持其穩(wěn)定的氨氧化能力意義重大。目前有關(guān)氨氧化細(xì)菌，尤其是高溫異養(yǎng)氨氧化細(xì)菌的菌種復(fù)壯技術(shù)鮮有報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)菌株BM62氨氧化能力的復(fù)壯技術(shù)進(jìn)行探討。

2.3 馴化復(fù)壯后菌株的顯色情況

將菌株BM62制成種子液，接種到不同處理的復(fù)壯培養(yǎng)基中，馴化培養(yǎng)后進(jìn)行氨氧化能力顯色檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)果顯示，未經(jīng)復(fù)壯的BM62的氨氧化能力顯色實(shí)驗(yàn)呈淺紅色，經(jīng)復(fù)壯馴化后的菌株中呈玫紅色和玫紫色的復(fù)壯培養(yǎng)菌液共有3瓶，瓶身標(biāo)記分別為A1、A2、A3，均為未添加外源營(yíng)養(yǎng)的復(fù)壯馴化培養(yǎng)基Ⅰ培養(yǎng)，其余添加不同含量有機(jī)質(zhì)的6瓶復(fù)壯培養(yǎng)液（瓶身標(biāo)記分別為6A1、6A2、6A3、12A1、12A2、12A3）顯色檢測(cè)結(jié)果較淡或幾乎不顯色，說(shuō)明添加外源有機(jī)營(yíng)養(yǎng)（牛肉膏、蛋白胨）并不利于此株氨氧化細(xì)菌的氨氧化能力復(fù)壯，因此這6瓶復(fù)壯培養(yǎng)液不進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 菌株BM62與其進(jìn)化關(guān)系相近種屬的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（最大似然法）

表3 菌株BM62馴化復(fù)壯后氨氧化能力檢測(cè)顯色

2.4 馴化復(fù)壯后的分離純化

將氨氧化能力顯色實(shí)驗(yàn)呈玫紅色和玫紫色編號(hào)為A1、A2、A3的培養(yǎng)液分別進(jìn)行平皿涂布培養(yǎng)及平皿劃線培養(yǎng)，其培養(yǎng)情況見(jiàn)表4。經(jīng)平皿涂布培養(yǎng)后，選擇其中15個(gè)大而獨(dú)立的菌落，編號(hào)分別為A1-1-1、A1-1-2、A1-1-3、A1-2-1、A1-2-2、A1-2-3、A2-2-1、A2-2-2、A2-2-3、A2-3-1、A2-3-2、A2-3-3、A3-1-1、A3-1-2、A3-1-3，進(jìn)一步進(jìn)行劃線培養(yǎng)純化。

表4 菌株BM62馴化復(fù)壯后的分離純化情況

2.5 馴化復(fù)壯后的單菌落氨氧化能力檢測(cè)

從15個(gè)單菌落劃線平皿中挑選出6個(gè)菌落長(zhǎng)勢(shì)良好的平皿，編號(hào)分別為A1-1-1、A2-2-1、A2-2-2、A2-3-3、A3-1-1、A3-1-2， 每 個(gè) 平 皿分別挑取2個(gè)大而獨(dú)立的菌落接入氨氧化細(xì)菌種子培養(yǎng)基，共得到12瓶復(fù)壯后的種子液，分別編號(hào) 為 AF1、AF2、AF3、AF4、AF5、AF6、AF7、AF8、AF9、AF10、AF11、AF12，調(diào)整種子液濃度為D600=0.1～0.15，接種至氨氧化細(xì)菌檢測(cè)培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)3 d后進(jìn)行氨氧化能力顯色檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表5。單菌落氨氧化能力顯色檢測(cè)結(jié)果呈玫紅（紫）色的即氨氧化能力強(qiáng)的菌落共6個(gè)，編號(hào)分別為 AF1、AF2、AF6、AF7、AF8、AF10。

2.6 復(fù)壯有效菌種的氨氧化活性測(cè)定

分別測(cè)定該6株優(yōu)選菌株在氨氧化細(xì)菌檢測(cè)培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后在540 nm處的吸光值，根據(jù)亞硝酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出其亞硝酸鈉濃度，用亞硝酸鈉濃度值代表相應(yīng)菌株的氨氧化活性值，結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 單菌落氨氧化能力檢測(cè)顯色

表6 復(fù)壯優(yōu)選6菌株培養(yǎng)3 d后的氨氧化活性（mg/L）

其中菌株AF1和AF8的氨氧化活性分別為36.5和34.7 mg/L，與菌株BM62退化前的氨氧化能力（用同樣的方法檢測(cè)計(jì)算得35.0 mg/L）相當(dāng)，AF1和AF8為此方法篩選所得復(fù)壯有效菌種。

3 討論

高溫堆肥是實(shí)現(xiàn)畜禽糞便減量化、無(wú)害化和資源化的有效措施［19-20］。然而，NH3揮發(fā)為主的氮素嚴(yán)重?fù)p失是目前畜禽糞便高溫堆肥技術(shù)面臨的瓶頸問(wèn)題。NH3快速轉(zhuǎn)化為是目前公認(rèn)的降低堆肥中氮素?fù)p失的技術(shù)途徑之一，氨氧化細(xì)菌可以將NH3氧化成NO2-，從而減少堆肥過(guò)程中的氨揮發(fā)，是畜禽糞便堆肥中的理想保氮微生物［6］。Aliibacillus thermotolerans BM62是本實(shí)驗(yàn)室在牛糞水稻秸稈堆肥高溫期分離得到的一株耐高溫異養(yǎng)氨氧化細(xì)菌，經(jīng)鑒定此菌株為芽孢桿菌科（Bacillaceae）的一個(gè)新屬。該菌株在50℃生長(zhǎng)活力和氨氧化能力最強(qiáng)，最重要的是，該菌株具有微好氧特性，可以完全適應(yīng)堆肥高溫階段的低溶氧環(huán)境。許多相關(guān)報(bào)道表明，NH3揮發(fā)主要發(fā)生在堆肥的高溫期，在此階段的釋放量可占到總揮發(fā)量的60%～70%［21-22］，然而絕大多數(shù)的氨氧化細(xì)菌均為中溫好氧菌，它們只能在堆肥降溫期發(fā)揮作用。由此可見(jiàn)，菌株Aliibacillus thermotolerans BM62適應(yīng)堆肥高溫階段的氨氧化能力使其具有極高的理論研究?jī)r(jià)值和實(shí)際生產(chǎn)意義。

然而，研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，Aliibacillus thermotolerans BM62在傳代過(guò)程中的氨氧化能力退化較為明顯，因此對(duì)其功能復(fù)壯工作也顯得尤為必要和急迫。常用的菌種復(fù)壯方法有菌種純化、更換適宜的培養(yǎng)基、控制菌種的傳代次數(shù)、采用適宜的保藏方法等［4］。由于菌株BM62具有氨氧化菌不易培養(yǎng)的特性［8，23］，其對(duì)培養(yǎng)基成分要求相對(duì)較高，因此，相對(duì)于其他的復(fù)壯措施，更換適宜培養(yǎng)基的方法更加有利于提高菌株BM62的復(fù)壯效果。菌株BM62在傳代中的功能退化，除了菌株自身遺傳學(xué)和細(xì)胞學(xué)原因以外，人工培養(yǎng)基成分與堆肥原環(huán)境營(yíng)養(yǎng)的差異也是重要影響因素。本實(shí)驗(yàn)的復(fù)壯結(jié)果也表明，菌株BM62在不加任何外源有機(jī)物的堆肥原環(huán)境復(fù)壯培養(yǎng)基的復(fù)壯效果最佳，而添加外源有機(jī)物的堆肥原環(huán)境營(yíng)養(yǎng)對(duì)該菌株的復(fù)壯并沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用。由此可以推測(cè)，堆肥原環(huán)境的樣品中含有促進(jìn)菌株BM62生長(zhǎng)和維持氨氧化能力的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的具體成分還有待于進(jìn)一步檢查驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在堆肥高溫期樣品中篩選得到一株高溫異養(yǎng)氨氧化細(xì)菌BM62，經(jīng)鑒定該菌株為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）芽孢桿菌科（Bacillaceae）的一個(gè)新屬細(xì)菌，暫命名為Aliibacillus thermotolerans BM62。

本研究同時(shí)提供了該株氨氧化細(xì)菌BM62的簡(jiǎn)單易行的氨氧化能力復(fù)壯方法。

菌株BM62在不加任何外源有機(jī)物的堆肥原環(huán)境復(fù)壯培養(yǎng)基的復(fù)壯效果最佳，經(jīng)復(fù)壯培養(yǎng)后，該菌株氨氧化活性為34.7～36.5 mg/L，與其退化前氨氧化能力（35.0 mg/L）相當(dāng)。