一種初步判斷細(xì)菌類微生物在土壤中定殖能力的方法

吳 翔，唐 亞，甘炳成*，彭衛(wèi)紅，謝麗源，譚 昊，陳 影，賈定洪，黃忠乾，譚 偉，唐 杰，何曉蘭

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南區(qū)域農(nóng)業(yè)微生物資源利用科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南山地農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066；2.四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，四川 成都 610065）

目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中化學(xué)肥料的施用給環(huán)境帶來的負(fù)面影響越來越受到人們重視，而微生物類肥料和農(nóng)藥制品因?yàn)槠洵h(huán)境友好性被認(rèn)為是其最佳的替代品或補(bǔ)充品。因此，功能微生物在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究越來越多，在大量的研究工作中篩選獲得的各類農(nóng)用功能微生物中細(xì)菌類占有重要的比例，它們成為研究重點(diǎn)的原因不僅因?yàn)樵谌绱偕?-2］、抗?。?-5］等功能方面效果明顯，也因?yàn)槠渖L(zhǎng)速度快，培養(yǎng)條件要求低。

從篩選獲得到生產(chǎn)應(yīng)用，功能微生物的定殖能力對(duì)其應(yīng)用潛力具有決定性作用，甚至有學(xué)者基于定殖能力來篩選功能微生物［6］，可見定殖能力對(duì)于功能菌株的重要性。決定功能微生物在植物根際定殖能力的影響因素較多［7］，對(duì)于在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)條件下分離、篩選所得的功能微生物，判斷它們?cè)趶?fù)雜的環(huán)境中的定殖能力是功能微生物從研發(fā)走向應(yīng)用的必經(jīng)之路。土壤是農(nóng)用功能微生物的主要應(yīng)用環(huán)境，目前檢測(cè)判斷該類功能微生物定殖能力的方法有盆栽［3，6，8］、田間試驗(yàn)［9］等，將功能微生物應(yīng)用于土壤，再通過分析定殖載體中功能微生物的數(shù)量來判斷其定殖能力的大小［10］。這種方法準(zhǔn)確，但是操作繁瑣、所需時(shí)間長(zhǎng)，不僅包括采集樣品、分離培養(yǎng)和對(duì)應(yīng)菌株的鑒定確認(rèn)等程序，還包括微生物施入載體的試驗(yàn)設(shè)計(jì)、場(chǎng)地選擇、環(huán)境條件分析等其它的配套設(shè)施投入和相關(guān)數(shù)據(jù)的分析檢測(cè)。因此，簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地判斷功能微生物在土壤中定殖能力的方法，不僅可以減少繁瑣的操作程序和功能微生物的研究開支，更能反向指導(dǎo)在研究過程中篩選出在應(yīng)用時(shí)可能具有強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)潛力的菌株，縮短功能微生物從研發(fā)到應(yīng)用的時(shí)間，對(duì)促進(jìn)微生物制品在農(nóng)業(yè)的應(yīng)用推廣，進(jìn)而推進(jìn)生態(tài)環(huán)境良好健康發(fā)展具有重要的意義。因此，選擇一個(gè)簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的方法判斷功能微生物在土壤中的生存能力的研究顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和抗生素藥敏片

本研究所用9株菌株為前期篩選所得對(duì)煙草生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用的功能微生物，分別編號(hào)1～9號(hào)，其中菌株中5、6、7號(hào)3株為放線菌，其余為細(xì)菌，它們分別是1號(hào)：Bacillus tequilensis，2號(hào)：Enterobacter asburiae，3號(hào)：Enterobacter xiangfangensis，4號(hào)：Klebsiella variicola，5號(hào)：Streptomyces pratensis，6 號(hào)：Streptomyces albidoflavus，7 號(hào)：Streptomyces. microflavus，8號(hào)：Pseudomonas aeruginosa，9號(hào)：Bacillus flexus。使用的藥敏試紙（北京）種類及含量見表1。

表1 21種抗生素藥敏片種類和濃度 （μ g/片）

1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌培養(yǎng)基為高氏一號(hào)［11］，混合發(fā)酵培養(yǎng)液：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.4。

1.3 抗生素藥敏片在菌株平板上產(chǎn)生抑菌圈直徑的分級(jí)

將供試9株微生物菌株分別于對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基瓊脂平皿上進(jìn)行平板涂布，再將21種抗生素藥敏片貼于瓊脂表面，靜置5 min后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置30℃培養(yǎng)24～48 h后，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑，計(jì)算其平均值［12］。每種抗生素3個(gè)重復(fù)，以不接菌的混合發(fā)酵培養(yǎng)液為空白對(duì)照（CK）。

根據(jù)21種抗生素藥敏片對(duì)待測(cè)菌株的抑菌圈直徑對(duì)其進(jìn)行分級(jí)：直徑為0 cm的為Ⅰ級(jí)，0 cm＜D≤1 cm為 Ⅱ 級(jí)，1 cm＜D≤ 2 cm為 Ⅲ級(jí)，2 cm＜D≤ 3 cm為Ⅳ級(jí)，3 cm＜D≤ 4 cm為Ⅴ級(jí)，4 cm＜D≤5 cm為Ⅵ級(jí)，…，并統(tǒng)計(jì)該菌株抑菌圈直徑在各個(gè)級(jí)別的數(shù)量。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)算待測(cè)菌株對(duì)抗生素的敏感值，計(jì)算公式如下。

抗生素敏感值=1×Ⅰ級(jí)范圍的數(shù)量+2×Ⅱ級(jí)范圍的數(shù)量+…+N×N級(jí)范圍的數(shù)量

1.4 利福平標(biāo)記菌株

為了準(zhǔn)確從盆栽土壤中檢出待測(cè)菌株，參考張冬冬等［13］的方法對(duì)各菌株進(jìn)行標(biāo)記。在培養(yǎng)基中加入濃度為50 μ g/mL的利福平，并按照50 μ g/mL的含量階梯式遞增濃度，馴化9株菌具有抗300 μ g/mL利福平的能力，將各馴化后的菌株分別編號(hào)為 1′～ 9′號(hào)。

對(duì)各菌株的抗300 μ g/mL利福平的標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證檢測(cè)，檢測(cè)方法為：將1′～9′號(hào)馴化菌分別與去掉各自出發(fā)菌株的1～9號(hào)菌進(jìn)行混合液體發(fā)酵，各組合為CK（全為出發(fā)菌，無馴化菌）、1R～9R號(hào)共計(jì)10組，各組合中包括的菌株如表2。用接種環(huán)挑取10組發(fā)酵好的搖瓶菌液在含300 μ g/mL利福平培養(yǎng)基劃線分離，通過檢測(cè)平板中分離所得菌株的形態(tài)特征等判斷其是否為各組合中的馴化菌驗(yàn)證標(biāo)記結(jié)果。

表2 各組合中包括的菌株說明

1.5 盆栽試驗(yàn)檢測(cè)菌株在土壤中的定殖能力

將10 kg于121℃高壓滅菌3 h的土壤分別裝入盆中，并與500 mL濃度為1.0×108cfu/mL的1′～9′號(hào)菌液混合，以相同量不接菌的培養(yǎng)液為對(duì)照，栽培煙草植株，每個(gè)菌液處理5個(gè)重復(fù)。在煙草的整個(gè)生長(zhǎng)期中，分別在種植后的第2、25、40、65 d采集各個(gè)處理中的土壤樣品，在含300 μ g/mL利福平培養(yǎng)基中采用稀釋平板涂布法計(jì)數(shù)其中的菌落含量。根據(jù)不同時(shí)期檢出馴化菌株的含量判斷菌株在土壤中定殖能力，并分析其定殖能力與抗生素敏感值的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素藥敏片在菌株平板上產(chǎn)生抑菌圈直徑的分級(jí)

以5號(hào)放線菌為例展示的藥敏片試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。21種抗生素藥敏片對(duì)CK及9個(gè)菌株抑菌圈直徑的大小如表3所示，由表3可知，沒有接入菌株的CK中放置21種藥敏片均無抑菌圈產(chǎn)生；各種藥敏片在含有9個(gè)菌株的平皿中產(chǎn)生的抑菌圈無明顯規(guī)律，最大抑菌圈是米諾環(huán)素對(duì)7號(hào)菌株產(chǎn)生的，達(dá)到4.37 cm；1～4號(hào)菌株藥敏片對(duì)其無抑菌圈的個(gè)數(shù)均大于等于10個(gè)，并且均無達(dá)到3 cm的抑菌圈產(chǎn)生；7號(hào)和9號(hào)菌株沒有無抑菌圈產(chǎn)生的藥敏片種類。根據(jù)21種藥敏片對(duì)各菌株產(chǎn)生的抑菌圈大小統(tǒng)計(jì)的抗生素敏感性分級(jí)情況及依據(jù)公式計(jì)算的敏感值如表4所示，敏感值最大的是7號(hào)菌株，最小的是4號(hào)菌株，分別是93 和 29，各菌株敏感值的排序?yàn)?7＞8＞9＞5＞6＞3＞1＞2＞4。

圖1 藥敏片試驗(yàn)（以5號(hào)菌為例）

表3 菌株對(duì)抗生素敏感性測(cè)試結(jié)果 （cm）

表4 各菌株抗生素敏感性分級(jí)及敏感值計(jì)算結(jié)果

2.2 利福平標(biāo)記結(jié)果

利用含300 μ g/mL利福平培養(yǎng)基劃線檢測(cè)10個(gè)發(fā)酵組合液中各馴化菌株標(biāo)記結(jié)果的試驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)照組合菌液在該平皿上無菌株生長(zhǎng)，而1 R～9 R發(fā)酵組合中均有純菌落生長(zhǎng)，根據(jù)其形態(tài)特征等方法進(jìn)行對(duì)比，長(zhǎng)出菌株分別為1′～9′號(hào)。從而證明9株馴化菌在眾多菌同時(shí)存在的情況下，可以在含300 μ g/mL利福平培養(yǎng)基中單獨(dú)分離出，具有排它性，可以將含300 μ g/mL利福平的培養(yǎng)基作為馴化菌株的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基。

2.3 盆栽測(cè)定菌株在土壤中的定殖能力

由表5可知，采集的4次樣品中，1′、2′、3′、4′、5′、6′號(hào)隨著時(shí)間推移其菌落數(shù)量都有所增加，而7′號(hào)、8′號(hào)的菌落則在第2次已經(jīng)無檢出，并且第1次檢測(cè)結(jié)果菌落數(shù)量8′號(hào)＞7′號(hào)，9′號(hào)在第3次無菌落檢出。由檢測(cè)結(jié)果可知，在整個(gè)樣品菌落分析所反應(yīng)出的各菌株的定殖能力從大到小都表現(xiàn)出了以下排序：4＞2＞1＞3＞6＞5＞9＞8＞7，這個(gè)排序和2.1中分析所得各菌株的敏感值大小所反映出的各菌株的定殖能力的排序剛好相反。由此證明用抗生素對(duì)菌株的抑菌圈直徑分級(jí)方法和敏感值計(jì)算方法判斷菌株在土壤中的定殖能力具有可行性，并且抗生素敏感值和其在土壤中的適應(yīng)定殖能力呈負(fù)相關(guān)。

另外，從分析結(jié)果中可以得知，當(dāng)菌株抗生素敏感值為83時(shí)（9′號(hào)），其定殖能力較敏感值為78（5′號(hào)）的菌株下降很多，并且在接入土壤40 d后9′號(hào)失去定殖能力，而當(dāng)菌株抗生素敏感值為85時(shí)（8′號(hào)），菌株在第1次樣品分析時(shí)期定殖能力已顯得極差，僅有29 cfu/g。由此判斷，當(dāng)菌株抗生素敏感值小于85時(shí)，菌株在土壤中有一定的定殖能力，而當(dāng)菌株抗生素敏感值大于85時(shí)，菌株基本失去在土壤中的定殖能力。

表5 各菌株4次采集樣品中在含300 μg/mL利福平培養(yǎng)基的菌落數(shù)量 （個(gè)/g）

3 結(jié)論與討論

抗生素被較廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等行業(yè)中，這些抗生素未被有效利用則會(huì)通過直接、循環(huán)等方式進(jìn)入包括土壤的環(huán)境中，另外，土壤中的微生物種類極為豐富，其中的放線菌可以產(chǎn)生絕大多數(shù)目前已知的抗生素種類［14］，這些抗生素對(duì)環(huán)境微生物群落進(jìn)化施加選擇壓力［15］，必然也影響寄入土壤中的功能菌株的定殖。本研究通過試驗(yàn)獲得一種初步判斷細(xì)菌類微生物在土壤中定殖能力的方法，該方法基于21種抗生素對(duì)菌株的抑菌情況進(jìn)行抑菌圈直徑分級(jí)，利用公式計(jì)算菌株敏感值，通過盆栽試驗(yàn)證明菌株的敏感值與其在土壤中的定殖能力呈負(fù)相關(guān)。證明可以通過計(jì)算細(xì)菌類微生物的敏感值的方法來判斷菌株在土壤中的定殖能力。本研究中通過公式計(jì)算敏感值大于85時(shí)，功能菌株在土壤中的定殖能力已較差，但確定定殖能力從有到無時(shí)敏感值的值，需要更多的試驗(yàn)來驗(yàn)證。

定殖能力作為農(nóng)用功能微生物投入生產(chǎn)應(yīng)用前重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)，其重要作用不言而喻。國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者就功能菌株的定殖能力作了不少研究，但關(guān)于菌株定殖環(huán)境的研究較少，如Donald等［16］認(rèn)為可以通過檢測(cè)菌株在土壤中產(chǎn)生的信號(hào)因子來判斷其在土壤中的定殖能力；董麗紅等［17］通過測(cè)定枯草芽孢桿菌NCD-2對(duì)5個(gè)不同棉花品種的根系分泌物的趨化作用，發(fā)現(xiàn)根系分泌物中氨基酸對(duì)NCD-2具有趨化性的影響；其它更多的研究集中于分析作者篩選所得的特定功能菌株的定殖能力，如Ameen等［18］研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌菌株FZB42在番茄根際定殖過程中，生物膜的形成起決定作用；Melent’ev等［19］的研究發(fā)現(xiàn)土壤溫度較低不利于抗病細(xì)菌在小麥根際的定殖，而土壤含水量與其定殖能力的強(qiáng)弱無關(guān)；婁海博等［20］研究發(fā)現(xiàn)，拮抗青枯病的熒光假單胞菌SN15-2在施入番茄根際后的前20 d定殖數(shù)量減少，20 d后基本穩(wěn)定，60 d時(shí)，在干土中的定殖數(shù)量可達(dá)3.67×105cfu/g。而這些已有的研究中，沒有對(duì)功能菌株在土壤中定殖能力簡(jiǎn)便的判斷方法，本研究對(duì)應(yīng)用于土壤的功能細(xì)菌類微生物的定殖潛力提出了新的評(píng)價(jià)方法，對(duì)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域生物肥料、生物農(nóng)藥等在應(yīng)用時(shí)篩選環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的菌株具有重要的指導(dǎo)意義。