IKKα對(duì)缺血再灌注損傷小鼠的保護(hù)作用及其對(duì)M1與M2型巨噬細(xì)胞的影響

陳 波1，張金盈，馬 平

心肌缺血再灌注(IR)損傷被認(rèn)為是以自身免疫反應(yīng)為特征的炎性疾病[1]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)超家族核轉(zhuǎn)錄因子參與免疫細(xì)胞的分化以及多種細(xì)胞(包括心肌細(xì)胞)的炎癥反應(yīng)[2]。研究表明，NF-κB在急性缺血再灌注損傷期間具有心臟保護(hù)作用，延遲激活NF-κB可增強(qiáng)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的表達(dá)從而誘發(fā)慢性炎癥[3]。IKK復(fù)合物是NF-κB信號(hào)通路的中樞調(diào)節(jié)因子，IKKα是IκB激酶(IKK)復(fù)合物的主要成員，研究顯示，IKKα對(duì)于巨噬細(xì)胞表型的活化有顯著影響，并且當(dāng)巨噬細(xì)胞缺乏IKK時(shí)趨向于分泌促炎因子[4]。因此，探討IKKα在心肌I/R損傷中的作用以及在心肌IR過(guò)程中IKKα對(duì)巨噬細(xì)胞表型的影響尤為重要。本研究采用IKKα條件性基因敲除小鼠探討IKKα對(duì)缺血再灌注損傷小鼠的保護(hù)作用，以及IKKα在心肌I/R損傷后對(duì)M1/ M2巨噬細(xì)胞的極化作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 兔抗小鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS，Boster PB0283)、抗表型標(biāo)記物(Arg1，Bioss bs-0465R)、抗IL-1β(Bioss bs-4947R)等一抗、tublin抗體均購(gòu)自美國(guó)Cayman Chemical公司；抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG(生產(chǎn)批號(hào)： ZB-2303)購(gòu)自北京中杉金橋公司；PV-6000免疫組化試劑盒及DAB顯色液均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 彩色多普勒超聲心動(dòng)圖儀(GE Vivid 7，USA)，生理記錄儀及RM6280多導(dǎo)生物信號(hào)處理系統(tǒng)(浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療儀器實(shí)驗(yàn)廠)；光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)(LEICA DMIRB，Germany)；漩渦混勻器(德國(guó)LEICA公司)；Shan-don325 型石蠟切片機(jī)(英國(guó)Shandon公司)；Genios多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士Tecan公司；BIO-RAD電泳、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；ChemiDoc TM XRS+凝膠成像儀器購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6-IKKα條件性基因敲除小鼠(mIKKα-/-)為mIKKα-/-組，同窩出生的年齡、性別匹配的小鼠IKKαflox/flox，6～8周，體質(zhì)量為20～25 g作為對(duì)照，記為IKKαflox/flox組，均購(gòu)自Jackson Laboratory公司。大鼠均無(wú)自發(fā)性心肌病及炎癥性疾病。

1.4 方法

1.4.1 缺血再灌注小鼠模型(MIRI)的制備 mIKKα-/-組(9只)與IKKαflox/flox組(9只)小鼠再分為假手術(shù)組(Sham組，3只)與MIRI模型組(6只)。C57BL/6-IKKα條件性基因敲除小鼠(mIKKα-/-)及同窩出生的年齡性別匹配的對(duì)照組小鼠各9只，各自分為MIRI模型組(6只)和假手術(shù)組(3只)，MIRI模型組操作：經(jīng)腹腔注射10%烏拉坦麻醉(1 mL/100 g)，采用仰臥位固定小鼠，并使用針型電極插入四肢皮下記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。于胸骨左緣 3～4肋間采用左胸正中旁切口開(kāi)胸，暴露心臟，在左心室與肺動(dòng)脈干之間結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，同時(shí)在結(jié)扎線與血管之間穿一直徑2 mm、長(zhǎng)5 mm的硅膠管，結(jié)扎30 min； 然后剪斷縫合線，取出硅膠管，再灌注觀察。Sham組僅分離前降支，不結(jié)扎。以收緊結(jié)扎線后動(dòng)物的心電圖標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián) ST-T段抬高，放松后抬高的ST-T下降1/2以上為MIRI模型建立成功[5]。

1.4.2 小鼠心臟超聲及血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 以上4組小鼠分別在心肌再灌注3 d和7 d(MIRI模型組心肌再灌注3 d和7 d后分別記為IR 3 d組與IR 7 d組)后，腹腔注射2%戊巴比妥麻醉，行心臟形態(tài)和功能檢測(cè)。測(cè)量指標(biāo)包括左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、舒張期室間隔厚度(IVSD)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室室壁心肌纖維縮短率(FS)。

1.4.3 小鼠心肌組織病理學(xué)檢測(cè) 以上4組小鼠分別于心肌再灌注3 d和7 d后處死，取左心室部分心肌，10%甲醛固定后進(jìn)行常規(guī)組織切片，HE及Masson染色，進(jìn)行病理學(xué)觀察，通過(guò)BI- 2000醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算心肌組織梗死面積及膠原附著面積(梗死面積/視野面積、膠原面積/視野面積)。

1.4.4 小鼠心肌組織炎性因子表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組小鼠心肌組織中炎性因子白細(xì)胞介素-12A(IL-12A) (1∶100， ab131039， Abcam)、TNF-α(1∶500，bs-2081R， Bioss)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)，1∶100， bs-0698R， Bioss)， CD68 (1∶500， ab125212， Abcam)相對(duì)表達(dá)量。SP法檢測(cè)心肌組織中以上因子的表達(dá)，已知陽(yáng)性片為陽(yáng)性對(duì)照，PBS緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照，采用Fromowitz半定量分析評(píng)分法對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量評(píng)分(0～7)[6]。

1.4.5 小鼠M1/M2型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)記物檢測(cè)[7]采用 Western Blot 法檢測(cè)各組小鼠心肌組織中誘導(dǎo)型氧化氮合酶(iNOS)、表型標(biāo)記物(Arg1)蛋白相對(duì)表達(dá)量[8-9]。心肌組織低溫研磨破碎，裂解，提取總蛋白，BCA蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，依次與一抗、二抗孵育，化學(xué)發(fā)光法獲取條帶，掃描膠片后用IPP 6.0 軟件進(jìn)行目的條帶的灰度分析，計(jì)算上述蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)小鼠心肌組織中M1型巨噬細(xì)胞iNOS、TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)量以及促M(fèi)2巨噬細(xì)胞因子[腫瘤壞死因子-β(TGF-β)、IL-10]、M2巨噬細(xì)胞Arg1 mRNA的表達(dá)量。RIzol試劑提取各組小鼠心肌組織總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取2 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外線投射儀下觀察電泳條帶，系統(tǒng)分析各目的基因和參比基因GAPDH的條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠心臟超聲及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 與IR 3 d時(shí)及Sham組比較，IKKαflox/flox及mIKKα-/-模型組IR7 d后LVIDd升高(P<0.05)；與Sham組、IR 3 d時(shí)及IKKαflox/flox模型組IR7 d后比較，mIKKα-/-模型組IR7 d后EF與FS均降低(P<0.05)。表明mIKKα-/-小鼠巨噬細(xì)胞IKKα基因的缺乏加劇了心肌缺血后的心室重構(gòu)。詳見(jiàn)圖1。

與IR 3 d及Sham組比較，*P<0.05； 與IKKαflox/flox模型組IR 7 d比較，#P<0.05； 與Sham組，IR 3 d及IKKαflox/flox模型組IR 7 d比較，△ P< 0.05。n=3。

2.2 各組小鼠心肌組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示：mIKKα-/-小鼠IR3 d后心肌炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)面積明顯大于IKKαflox/flox組；Masson染色結(jié)果顯示：mIKKα-/-小鼠IR7 d后心肌纖維化面積明顯大于IKKαflox/flox組；并且mIKKα-/-小鼠心肌間質(zhì)充血、出血明顯，血管明顯擴(kuò)張，局灶性心肌出血，片狀心肌肌纖維斷裂，廣泛的心肌細(xì)胞水腫、變性，心肌斷裂壞死較為嚴(yán)重。詳見(jiàn)圖2。mIKKα-/-小鼠IR3 d及7 d心肌梗死面積及膠原附著面積明顯大于IKKαflox/flox組(P<0.05)。表明mIKKα-/-小鼠巨噬細(xì)胞IKKαflox/flox基因的缺乏加劇了心肌缺血后心肌細(xì)胞的病變。詳見(jiàn)圖3。

圖2 各組小鼠心肌組織病理學(xué)切片結(jié)果(×400)

與IKKαflox/flox IR 3 d比較，*P<0.05；與mIKKα-/- IR 7 d比較，#P< 0.05。n=3。

2.3 各組小鼠心肌組織中炎性因子免疫組化檢測(cè)結(jié)果 與Sham組比較，IKKαflox/flox及mIKKα-/-模型組IL-12A、IL-10、CD68陽(yáng)性區(qū)域評(píng)分均升高(P<0.05)，與IKKαflox/flox模型組比較，mIKKα-/-模型組小鼠心肌細(xì)胞的促炎因子(IL-12A、TNF-α)的表達(dá)量升高，兩者病理學(xué)陽(yáng)性區(qū)域評(píng)分在造模后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但抗炎因子IL-10的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；由CD68免疫組化檢測(cè)結(jié)果可知，IKKαflox/flox及mIKKα-/-模型組心肌組織中均有大量巨噬細(xì)胞聚集，并且在炎癥浸潤(rùn)區(qū)域中mIKKα-/-組的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯高于IKKαflox/flox組。表明mIKKα-/-小鼠IKKα基因缺陷誘導(dǎo)的心肌炎癥反應(yīng)可能與心肌巨噬細(xì)胞聚集有關(guān)。詳見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 各組小鼠心肌組織炎性因子免疫組化檢測(cè)病理切片結(jié)果(×400)

與mIKKα-/-IR 3 d比較，*P<0.05； 與 IKKαflox/flox IR 7 d比較， #P<0.05。n=3。

2.4 各組小鼠心肌組織M1、M2型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)記物檢測(cè)結(jié)果 各組小鼠心肌組織中M1型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)記物iNOS蛋白及M2型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)記物Arg1蛋白的表達(dá)如圖6所示，Sham組小鼠兩種蛋白的表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；mIKKα-/-組小鼠iNOS蛋白的表達(dá)量高于IKKαflox/flox組小鼠，Arg1蛋白的表達(dá)量低于IKKαflox/flox組小鼠(P<0.05)。各組小鼠心肌組織中M1、M2型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)記物mRNA的表達(dá)量如圖7所示，與IKKαflox/flox組小鼠比較，mIKKα-/-組小鼠M1型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)記物(iNOS、TNF-α、IL-1β)mRNA的表達(dá)量增加，M2型巨噬細(xì)胞Arg1mRNA的表達(dá)量降低(P<0.05)，促M(fèi)2巨噬細(xì)胞極化因子(TGF-β、IL-10)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明在小鼠心肌組織中敲除IKKα基因會(huì)誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞的活化和抑制M2型巨噬細(xì)胞的活化，因此，IKKα基因可能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞聚集并向M1型活化。

3 討 論

本研究證實(shí)，IKKα是巨噬細(xì)胞活化的內(nèi)在正調(diào)節(jié)劑，并且保護(hù)心臟免受心肌IR損傷。通過(guò)基因敲除小鼠證明，巨噬細(xì)胞缺乏IKKα，心肌IR損傷后炎癥反應(yīng)及心室重構(gòu)將更加嚴(yán)重。但值得注意的是，這種對(duì)心肌IR損傷的保護(hù)作用與巨噬細(xì)胞對(duì)M1表型的活化有關(guān)，但對(duì)于其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究，靶向作用于IKKα可能有效預(yù)防心肌IR損傷。

IκB激酶復(fù)合物(IKKα、IKKβ和IKKγ)在NF-κB途徑中起關(guān)鍵作用，NF-κB途徑涉及多種細(xì)胞(包括心肌細(xì)胞)的炎癥反應(yīng)及免疫細(xì)胞的分化[8-9]。研究顯示，IKKα的表達(dá)量在IR小鼠模型升高，但I(xiàn)KKβ或IKKγ的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IKKγ是IKK復(fù)合物穩(wěn)定性調(diào)節(jié)劑，KKβ是NF-κB經(jīng)典途徑的重要因子，但到目前為止，對(duì)IKKγ及IKKβ在心肌IR損傷或心肌梗死中的作用無(wú)相關(guān)研究報(bào)道，因此，有待后續(xù)開(kāi)展IKKβ和IKKγ在心血管疾病中的相關(guān)研究。

IR損傷是組織器官暫時(shí)性缺血隨后恢復(fù)灌注時(shí)的病理狀態(tài)，恢復(fù)缺血性器官的血供對(duì)于防止組織不可逆損傷至關(guān)重要，但再灌注可能導(dǎo)致局部和全身炎癥反應(yīng)，與此同時(shí)，各種細(xì)胞因子持續(xù)產(chǎn)生和釋放會(huì)加劇早期組織炎癥損傷[10]。本研究結(jié)果顯示，組織損傷程度與炎性因子的增加具有一定的相關(guān)性，與同窩小鼠野生型IKKαflox/flox相比，mIKKα-/-小鼠顯示出較為嚴(yán)重的炎癥損傷和纖維化，并且心肌組織的恢復(fù)較為緩慢。IKKαflox/flox與mIKKα-/-小鼠在建立IR模型第3天時(shí)均無(wú)心功能不全，但mIKKα-/-小鼠心臟功能IR 7 d后，F(xiàn)S和EF顯示明顯降低，這可能歸因于在IR后形態(tài)及功能變化時(shí)的代償反應(yīng)。

中性粒細(xì)胞聚集和巨噬細(xì)胞遷移在IR后的心肌損傷中有重要作用。巨噬細(xì)胞參與IR損傷期間的先天性和適應(yīng)性免疫，并且在免疫應(yīng)答的起始和效應(yīng)階段起關(guān)鍵作用。M1巨噬細(xì)胞在某些病原體誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中必不可少，同時(shí)會(huì)對(duì)機(jī)體組織產(chǎn)生過(guò)度的免疫損傷[11]。相比之下，M2巨噬細(xì)胞在組織穩(wěn)態(tài)和修復(fù)方面具有強(qiáng)大的抗炎特性。本研究結(jié)果顯示，mIKKα-/-小鼠心肌組織中CD68等驗(yàn)證因子表達(dá)增加，這意味著有大量的巨噬細(xì)胞聚集，與此同時(shí)，心肌M1巨噬細(xì)胞標(biāo)記物iNOS的上調(diào)和M2巨噬細(xì)胞標(biāo)記物Arg1的下調(diào)表明IR損傷后第3天mIKKα-/-組巨噬細(xì)胞趨于活化為M1型，促炎因子IL-12A和TNF-α顯著增加，從而使心肌組織的炎癥反應(yīng)更加嚴(yán)重，對(duì)于抗炎因子IL-10的差異可能與由于IR后心肌中巨噬細(xì)胞殘留的保護(hù)作用有關(guān)。

綜上所述，IKKα對(duì)缺血再灌注損傷小鼠的炎癥反應(yīng)具有保護(hù)作用，該作用可能與IKKα調(diào)節(jié)心肌巨噬細(xì)胞聚集并向M1型巨噬細(xì)胞活化有關(guān)。

與 IKKαflox/flox IR 3 d組比較，*P<0.05。n=3。

與 mIKKα-/- IR 3 d比較，*P<0.05； 與Sham組比較，#P< 0.05。n=3。