C反應(yīng)蛋白基因單核苷酸多態(tài)性與缺血性腦卒中相關(guān)性的Meta分析

腦卒中發(fā)病率高，已成為我國(guó)致死的第一大病因，給社會(huì)、家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[1]。傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素諸如高血壓病、糖尿病、肥胖、高同型半胱氨酸血癥、吸煙及飲酒等僅能解釋部分事件，因此，腦卒中發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明。缺血性腦卒中(ischemic stroke， IS)作為卒中的常見亞型，是一種環(huán)境和遺傳因素相互作用的多基因病[2-3]。在眾多的IS候選基因中，C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein， CRP)作為一種參與動(dòng)脈粥樣硬化的炎性標(biāo)記物[4]，與IS的發(fā)生[5-6]及預(yù)后[7]密切相關(guān)。大量流行病學(xué)資料和臨床研究已經(jīng)證實(shí)，CRP基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism， SNP)與血漿CRP水平密切相關(guān)[8-9]。近年來(lái)，亦有多項(xiàng)研究報(bào)道認(rèn)為CRP基因SNP與IS易感相關(guān)，如rs1800947、rs3093059。然而由于種群間異質(zhì)性、單個(gè)研究統(tǒng)計(jì)效力的局限性等因素的影響，使得結(jié)果頗有爭(zhēng)議。Chen等[10-11]研究認(rèn)為rs1800947與IS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。Shen等[8]研究顯示rs3093059與IS的易感性相關(guān)。Morita等[12]在日本人群中研究發(fā)現(xiàn)，rs1800947位點(diǎn)C等位基因與IS的發(fā)生相關(guān)。而Ladenvall 等[13]在瑞典人群、Das等[14]在印度人群證實(shí)了rs1800947多態(tài)性與IS無(wú)關(guān)。Chen等[15]研究顯示rs3093059與IS的易感性無(wú)關(guān)。探究CRP 基因在IS發(fā)生中的具體作用機(jī)制，對(duì)于IS的預(yù)防、治療及預(yù)后具有重要意義。基于此，通過收集CRP基因rs1800947、rs3093059位點(diǎn)多態(tài)性與IS相關(guān)性的病例對(duì)照研究，運(yùn)用Meta分析的方法對(duì)既往研究結(jié)果進(jìn)行綜合定量評(píng)價(jià)，提高關(guān)聯(lián)分析統(tǒng)計(jì)效力，進(jìn)一步得出更為貼切的結(jié)論，以期為IS臨床用藥靶點(diǎn)和預(yù)防提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①國(guó)內(nèi)外公開發(fā)表的關(guān)于CRP基因rs1800947(1059G>C)、rs3093059(-757T>C)多態(tài)性與IS相關(guān)性的文獻(xiàn)；②病例對(duì)照研究；③IS的診斷符合全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的《腦卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)》；④樣本量明確，各基因型及等位基因數(shù)據(jù)可直接獲得或通過數(shù)據(jù)計(jì)算獲得；⑤對(duì)照組基因頻率分布符合哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg eguilibrium，HWE)遺傳平衡定律；⑥納入文獻(xiàn)若同時(shí)報(bào)道兩個(gè)不同人群的研究結(jié)果，每個(gè)人群在Meta分析中將視為一個(gè)獨(dú)立的研究報(bào)道。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①非入選基因位點(diǎn)；②重復(fù)報(bào)道，文獻(xiàn)質(zhì)量差；③數(shù)據(jù)不完整或通過計(jì)算不能得出完整數(shù)據(jù)；④非病例對(duì)照研究。

1.2 納入文獻(xiàn)的檢索流程與篩選 檢索數(shù)據(jù)庫(kù)包括：PubMed、MedLine、Springer、EMbase、OVID、Cochrane Library、中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)(CNKI)、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(CBM)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)(WanFang Data)、維普中文期刊數(shù)據(jù)庫(kù)(VIP)中，檢索時(shí)間自數(shù)據(jù)庫(kù)建庫(kù)至2020年1月1日。中文檢索式：(腦卒中 OR 腦梗死 OR 腦中風(fēng)) AND (C反應(yīng)蛋白 OR CRP) AND (基因 OR 多態(tài)性)。英文檢索式：(C reactive protein OR CRP) AND (ischemic stroke OR cerebral infarction OR cerebral ischemia)AND (polymorphism OR polymorphisms OR genotype OR genetic OR gene)。并通過手動(dòng)檢索文獻(xiàn)的方式，追溯查找可能的相關(guān)文獻(xiàn)。以PubMed為例，其具體檢索策略為：

#1 C reactive protein

#2 CRP

#3 ischemic stroke

#4 cerebral infarction

#5 cerebral ischemia

#6 polymorphism

#7 polymorphisms

#8 genotype

#9 genetic

#10 gene

#11 (#1 OR #2) AND (#3 OR #4 OR #5) AND (#6 OR #7 OR #8 OR #9 OR #10)

1.3 文獻(xiàn)篩選、資料提取及質(zhì)量評(píng)價(jià) 本研究由兩名研究者進(jìn)行文獻(xiàn)篩選，并進(jìn)行交叉核對(duì)，不一致時(shí)進(jìn)行討論或提交至第三方解決。提取信息包括第一作者姓(名)、發(fā)表年份、病例組和對(duì)照組的人數(shù)、基因型及等位基因分布數(shù)據(jù)、實(shí)驗(yàn)方法、次要等位基因頻率，對(duì)照組來(lái)源等。納入文獻(xiàn)質(zhì)量采用Newcastle-Ottawa Scale(NOS)量表進(jìn)行評(píng)價(jià)，以星級(jí)對(duì)病例組和對(duì)照組的選擇、可比性以及危險(xiǎn)因素的暴露情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，當(dāng)評(píng)分≥6分為高質(zhì)量文獻(xiàn)。

1.4 研究效應(yīng)測(cè)定指標(biāo) CRP基因SNP與IS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)采用以下3種模型。①顯性效應(yīng)模型：以野生型(WT)為對(duì)照，計(jì)算雜合型(HT)和突變型(MT)與IS風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)程度；②隱性效應(yīng)模型：以WT+HT為對(duì)照，計(jì)算MT與IS風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)程度；③等位基因模型：rs1800947、rs3093059分別以G等位基因、T等位基因?yàn)閷?duì)照，計(jì)算C等位基因與IS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)程度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Review Manager 5.1軟件進(jìn)行Meta分析。以比值比(odds ratio， OR)和95%置信區(qū)間(95%CI)作為每項(xiàng)研究結(jié)果的研究效應(yīng)指標(biāo)。采用Q檢驗(yàn)評(píng)估研究間的異質(zhì)性[16]，若存在顯著異質(zhì)性(P≤0.10，I2>50%)，則選用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行合并；若無(wú)顯著異質(zhì)性(P>0.10，I2<50%)，則選擇固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并。計(jì)算病例組和對(duì)照組 rs1800947位點(diǎn)顯性模型(GG與GC+CC)、等位基因模型(G與C)，以及rs3093059顯性模型 (TT與TC+CC)，隱性模型(TT+TC 與 CC)、等位基因模型(T與C)比較的合并OR值及95%CI。采取逐一排除的方法進(jìn)行敏感性分析。應(yīng)用STATA 10.0軟件Egger檢驗(yàn)進(jìn)行發(fā)表偏倚評(píng)價(jià)。當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為存在發(fā)表偏倚。

2 結(jié) 果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果 本研究經(jīng)初步數(shù)據(jù)庫(kù)檢索共獲得相關(guān)文獻(xiàn)157篇，經(jīng)過逐層篩選，共納入9篇[8-12，17-20]文獻(xiàn)，其中陳聲妹等[17]為兩項(xiàng)研究，故最終共納入10項(xiàng)研究。本研究納入文獻(xiàn)NOS量表評(píng)分均大于6分，提示納入文獻(xiàn)質(zhì)量較好。文獻(xiàn)篩選流程見圖1。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

2.2 納入文獻(xiàn)的基本特征(見表1)

表1 納入文獻(xiàn)的基本特征

注： PHWE為Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)；MAF為最小等位基因頻率。

2.3 Meta分析

2.3.1 CRP基因rs1800947位點(diǎn)與IS的相關(guān)性 各研究rs1800947位點(diǎn)各基因型分布見表1。5篇文獻(xiàn)比較了病例組和對(duì)照組rs1800947位點(diǎn)的頻率分布差異[10-12，17-18]，其中陳聲妹等[17]分別報(bào)道了海南籍黎族和漢族人群，故最終納入6項(xiàng)研究，累計(jì)病例組721例，對(duì)照組1 043例。因rs1800947位點(diǎn)CC基因型頻率較低，故僅對(duì)顯性模型、等位基因模型進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各研究顯性模型比較存在異質(zhì)性(I2=66%，P=0.01)，故采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析，合并效應(yīng)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[OR=1.30，95%CI(0.74，2.26)，P=0.36]。詳見圖2。各研究等位基因模型也存在異質(zhì)性(I2=69%，P=0.007)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型合并，結(jié)果顯示[OR=1.25，95%CI(0.72，2.18)，P=0.42]。詳見圖3。

圖2 兩組rs1800947位點(diǎn)顯性模型比較的Meta分析

圖3 兩組rs1800947位點(diǎn)等位基因模型比較的Meta分析

2.3.2 CRP基因rs3093059位點(diǎn)與IS的相關(guān)性 各研究rs3093059位點(diǎn)各基因型分布見表1。5篇文獻(xiàn)比較了病例組和對(duì)照組rs3093059位點(diǎn)的頻率分布差異[8-10，19-20]，累計(jì)病例組1 790例，對(duì)照組3 065例。顯性模型各研究間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性可接受(I2=23%，P=0.29)，采用固定效應(yīng)模型分析，結(jié)果顯示CRP基因rs3093059位點(diǎn)頻率分布降低[OR=0.88， 95%CI(0.78，0.99)，P=0.04]。詳見圖4。隱性模型比較亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性(I2=11%，P=0.34)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示合并效應(yīng)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[OR=1.09， 95%CI(0.77，1.55)，P=0.62]。詳見圖5。等位基因模型比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性(I2=38%，P=0.17)，采用固定效應(yīng)模型分析，結(jié)果顯示合并效應(yīng)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[OR=0.91， 95%CI(0.82，1.02)，P=0.10]。詳見圖6。

圖4 兩組rs3093059位點(diǎn)顯性模型比較的Meta分析

圖5 兩組rs3093059位點(diǎn)隱性模型比較的Meta分析

圖6 兩組rs3093059位點(diǎn)等位基因模型比較的Meta分析

2.4 敏感性分析

2.4.1 rs1800947位點(diǎn)敏感性分析 采用逐一排除的方法進(jìn)行敏感性分析，發(fā)現(xiàn)剔除鄧可等[11]研究后，兩組顯性模型比較結(jié)果發(fā)生反轉(zhuǎn)。兩組顯性模型比較中，各研究無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性(I2=39%，P=0.16)，采用固定效應(yīng)模型分析，結(jié)果OR=1.62，95%CI(1.16，2.28)，P=0.005。兩組等位基因模型比較，各研究存在統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性(I2=51%，P=0.09)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析，OR=1.54，95%CI(0.96，2.46)，P=0.07。

2.4.2 rs3093059位點(diǎn)敏感性分析 采用逐一排除的方法進(jìn)行敏感性分析，結(jié)果均未發(fā)生方向性變化，提示結(jié)果穩(wěn)定性較好。

2.5 發(fā)表偏倚評(píng)估 采用STATA 10.0軟件對(duì)發(fā)表偏倚進(jìn)行評(píng)價(jià)。rs1800947位點(diǎn)、rs3093059位點(diǎn)顯性模型、隱性模型、等位基因模型進(jìn)行Egger檢驗(yàn)。結(jié)果提示各模型發(fā)表偏倚對(duì)結(jié)果影響較小(P>0.05)。詳見表2。

表2 CRP基因rs1800947和rs3093059發(fā)表偏移的Egger檢驗(yàn)

3 討 論

研究表明，CRP作為動(dòng)脈粥樣硬化的炎性反應(yīng)標(biāo)志物，與IS的發(fā)生密切相關(guān)[4-5]。CRP基因位于1q 21～1q23，基因組全長(zhǎng)2.3 kb，包括1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子，共編碼206個(gè)氨基酸。既往研究證實(shí)血CRP水平受遺傳因素的影響可達(dá)22%～56%[21-22]。其中，rs1800947G>C是位于第2外顯子的一個(gè)氨基酸同義變異，可能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)量的改變導(dǎo)致疾病發(fā)生。而rs3093059T>C位于啟動(dòng)子區(qū)，其可能在一定程度上調(diào)控CRP基因的表達(dá)，二者均突變頻率較高。既往研究已證實(shí)，二者等位基因突變可影響血壓及CRP水平，且與頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系密切[23-24]。

本研究納入的10項(xiàng)研究，CRP基因rs1800947、rs3093059與IS的相關(guān)性結(jié)果并不一致。部分研究認(rèn)為突變基因型增加IS易感性[10，12，17]，部分研究認(rèn)為與IS發(fā)生無(wú)關(guān)[5，9，10，17，20]，甚至部分文獻(xiàn)報(bào)道可降低IS的易感性[8，11，19]。各研究種族、對(duì)照來(lái)源、分子生物學(xué)技術(shù)、人群暴露因素等存在差異，可能導(dǎo)致文獻(xiàn)間出現(xiàn)異質(zhì)性。因此，CRP基因多態(tài)性與IS發(fā)生的關(guān)系仍是困擾研究人員的難題。

本研究涉及rs1800947位點(diǎn)包含6項(xiàng)研究，共納入病例組721例，對(duì)照組1 043例，納入研究結(jié)果間存在較大的異質(zhì)性，結(jié)果僅能表明亞洲人群，尤其中國(guó)人群rs1800947多態(tài)性與IS易感性不相關(guān)。而Chen等[10]、Morita等[12]認(rèn)為rs1800947位點(diǎn)C等位基因可增加IS的易感性，鄧可等[11]認(rèn)為C等位基因可降低IS易感性，與本研究結(jié)果不同。通過敏感性分析，剔除鄧可等[11]研究后，各研究間異質(zhì)性變小，兩組顯性模型、等位基因模型比較結(jié)果發(fā)生反轉(zhuǎn)。各研究結(jié)論的不一致以及本次Meta結(jié)果的不穩(wěn)定性可能仍與目前研究較少有關(guān)，雖Egger檢驗(yàn)無(wú)顯著發(fā)表偏移，但仍需要以后開展更多關(guān)于CRP基因rs1800947多態(tài)性與IS易感性的研究來(lái)證實(shí)兩者關(guān)系。本研究結(jié)論與國(guó)外Ladenvall等[13]、與Kuhlenbaeumer等[25]研究結(jié)論一致。Ladenvall 等[13]為一項(xiàng)瑞典人群病例對(duì)照研究，納入600例IS病人和600例匹配的對(duì)照人群，證實(shí)rs1800947與IS無(wú)關(guān)。Kuhlenbaeumer等[25]為德國(guó)人群病例對(duì)照研究，納入了1 699例IS卒中病人和1 432例對(duì)照人群，雖證實(shí)rs1800947與IS亞型(小動(dòng)脈閉塞型卒中)發(fā)生密切相關(guān)，但與整體IS發(fā)生無(wú)關(guān)。以上兩項(xiàng)研究因數(shù)據(jù)無(wú)法獲得，遺憾未納入本次Meta分析。

本研究對(duì)CRP基因rs3093059多態(tài)性與IS發(fā)生的相關(guān)性共納入5項(xiàng)研究，病例組1 790例，對(duì)照組3 065例，均為中國(guó)人群，顯性模型研究發(fā)現(xiàn)(TC+CC)基因型與IS易感性呈負(fù)相關(guān)，而隱性模型與等位基因模型分析得出陰性結(jié)論。納入研究結(jié)果間顯性模型異質(zhì)性小，采用逐一排除的方法進(jìn)行敏感性分析，結(jié)果均未發(fā)生方向性變化，提示結(jié)果穩(wěn)定性較好。本次分析結(jié)果表明，中國(guó)人群攜帶CRP基因rs3093059位點(diǎn)攜帶(TC+CC)基因型較TT基因型IS易感性下降。通過Egger檢驗(yàn)對(duì)發(fā)表偏倚進(jìn)行定量分析后，發(fā)現(xiàn)rs3093059各模型均無(wú)明顯發(fā)表偏移，提示結(jié)果可信。但由于本研究納入文獻(xiàn)數(shù)較少，部分程度上可能影響結(jié)論的可信度。

本研究亦存在一定的局限性。首先，本研究納入文獻(xiàn)均為病例-對(duì)照研究，無(wú)法避免在人群來(lái)源、分配和實(shí)施等階段帶來(lái)的偏倚風(fēng)險(xiǎn)；其次，本研究納入研究數(shù)量少，未能從亞組分析探討異質(zhì)性來(lái)源，可能會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；最后，納入人群幾乎為中國(guó)人群，尚需擴(kuò)大檢索范圍，補(bǔ)充全球有關(guān)CRP基因與IS關(guān)聯(lián)的研究，進(jìn)一步增強(qiáng)研究對(duì)象的代表性、研究結(jié)果的科學(xué)性。

綜上所述，本研究表明CRP基因rs1800947位點(diǎn)與IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)不相關(guān)，而人群rs3093059位點(diǎn)攜帶(TC+CC)基因型較TT基因型IS易感性下降，為初步確定IS易感人群提供了部分客觀的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。由于受納入研究數(shù)量的限制，上述研究結(jié)論尚待更多高質(zhì)量研究予以驗(yàn)證?；诖?，需要在以后的研究中統(tǒng)一方法，充分考慮研究種族、對(duì)照來(lái)源、環(huán)境暴露等因素，以增強(qiáng)各研究的科學(xué)性及可比性。