基于p38MAPK/Nrf2/HO-1 通路探討清達顆粒對脂多糖誘導(dǎo)活化的小膠質(zhì)細胞抗氧化作用研究

23蔡巧燕23沈阿靈2褚劍鋒23彭 軍23

高血壓是最為常見的心腦血管疾病，它是威脅人類生命健康的重要疾病之一，也是損害人體重要靶器官如心、腦、腎等的元兇。研究表明，在高血壓狀態(tài)下，腦部會出現(xiàn)不同程度的出血性或缺血性損傷等高血壓并發(fā)癥[1]，在發(fā)生損傷時，體內(nèi)或細胞內(nèi)自由基和丙二醛等有害化學(xué)基團迅速增多，導(dǎo)致線粒體功能障礙，加重細胞興奮毒性，促進神經(jīng)元脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和 DNA過氧化損傷和炎癥反應(yīng)[2]，并進一步造成細胞損傷和壞死以及腦血管病變，最終對大腦皮層造成損傷[1]。因此，抗氧化損傷是防治由高血壓引起的腦損傷并發(fā)癥的重要措施之一。通過抗氧化治療清除由于腦損傷增多的自由基，并抑制其生成從而減輕活性氧(ROS)在腦內(nèi)蓄積引起的細胞毒性反應(yīng)[3]，生成抗氧化物質(zhì)來防御神經(jīng)元脂質(zhì)、DNA和蛋白質(zhì)造成的氧化損傷，起到保護神經(jīng)細胞的作用，進而減輕腦組織損傷[4]。p38MAPK/Nrf2/HO-1通路被證實與諸多器官的抗氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，該通路的下游產(chǎn)物血紅素加氧酶(HO-1)是經(jīng)典的抗氧化劑酶，具有良好的抑制氧化應(yīng)激及炎癥的作用[5]。

清達顆粒(QDG)是由陳可冀院士運用幾十年的臨床經(jīng)驗方清眩降壓湯化裁而成，由天麻、鉤藤、黃芩、蓮子心4味藥物組成，具有清肝熱、平肝陽、泄心火之功效。有研究表明清達顆?？捎行Э刂谱园l(fā)性高血壓大鼠血壓對心、腎等靶器官的損害[6]。而方中單味藥的有效成分如天麻素、黃芩苷、異鉤藤堿等均可對細胞炎癥反應(yīng)及氧化損傷有一定的抑制功效[7-10]，甲基蓮心堿亦對神經(jīng)細胞有明確的抗氧化應(yīng)激功效[11]。但是目前對清達顆粒本身潛在的抗氧化應(yīng)激功效研究尚不充分。本研究擬通過脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠腦小膠質(zhì)細胞株構(gòu)建細胞炎癥反應(yīng)模型，觀察清達顆粒對炎癥細胞抗氧化應(yīng)激的影響，并探究其對p38MAPK/Nrf2/HO-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物與細胞株 清達顆粒是由天麻12 g、鉤藤10 g、黃芩6 g、蓮子心5 g配伍制成的顆粒制劑，由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：CKJ2017001；小鼠小膠質(zhì)細胞株BV-2，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

1.2 實驗試劑 RPIM 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、EDTA-0.25%胰蛋白酶、雙抗(青-鏈霉素混合液)，美國Hyclone公司；LPS，美國Sigma公司；MTT粉末，美國Sigma公司；ROS、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒，南京建成生物科技有限公司；細胞核蛋白質(zhì)提取試劑盒，生工生物工程股份有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術(shù)公司；p-p38(4511S)、p38(8690S)、TBP(8515S)，美國CST公司；Nrf2(16396-1-AP)、HO-1(10701-1-AP)，美國proteintech公司；小鼠/大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(貨號VAL609)，NOVUS公司；p38MAP激酶抑制劑(LY2228820，貨號A5566)，Apexbio公司。

1.3 實驗儀器 細胞培養(yǎng)箱、超微量高精度紫外/可見光分光光度計，美國Thermo公司；CaryEclipse熒光分光光度計，美國Varian公司；超凈工作臺，蘇州市安泰儀器設(shè)備有限公司；EK800酶標儀，美國基因有限公司；蛋白電泳儀，美國Bio-Red公司。

1.4 清達顆粒母液的制備 稱取清達顆粒粉末5 mg，加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)溶液至1 mL，置于超聲儀器溶解30 min，獲得濃度為5 mg/mL的清達顆粒母液，放置于-20 ℃冰箱中保存待用。

1.5 BV-2細胞培養(yǎng)與傳代 BV-2小鼠小膠質(zhì)細胞貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)、1%雙抗的RPMI-1640，置于含5%二氧化碳(CO2)、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液。每隔2 d傳代，待細胞處于對數(shù)生長期時用于實驗。

1.5.1 MTT法檢測不同濃度LPS對BV-2細胞的細胞活力影響 BV-2細胞以每孔1.5×105個密度，每孔100 μL，接種于96孔板。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，吸去上清液，換成空白培養(yǎng)基孵育4 h。吸去上清液后加入含有LPS (1 μg/mL、3 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL)的完全培養(yǎng)基，空白對照組則加入完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h后，吸去上清液 ，每孔加入0.5 mg/mL MTT 溶液100 μL。37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入100 μL 二甲基亞砜(DMSO)充分振蕩 10 min 溶解結(jié)晶，用酶標儀在570 nm 處測定吸光度。

1.5.2 MTT法檢測不同濃度清達顆粒對BV-2細胞的細胞活力影響 BV-2細胞以每孔1.5×105密度，每孔100 μL，接種于96孔板。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，吸去上清液，換成空白培養(yǎng)基孵育4 h。吸去上清液后加入含有清達顆粒(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL、250.00 μg/mL、500.00 μg/mL)的完全培養(yǎng)基中，空白對照組則加入完全培養(yǎng)基中，繼續(xù)孵育24 h后，吸去上清液，每孔加入0.5 mg/mL MTT 溶液100 μL。37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄去上清液，每孔加入100 μL DMSO 充分振蕩 10 min 溶解結(jié)晶，用酶標儀在570 nm 處測定吸光度。

1.5.3 MTT法檢測清達顆粒對LPS干預(yù)的BV-2細胞的細胞活力影響 根據(jù)實驗結(jié)果，選擇1 μg/mL LPS以及31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL 3個濃度的QDG溶液進行干預(yù)實驗。BV-2細胞以每孔1.5×105密度，每孔100 μL，接種于96孔板。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，吸去上清液，換成空白培養(yǎng)基孵育4h。吸去上清液后分別加入清達顆粒(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)和/或1 μg/mL LPS，還有一組加入完全培養(yǎng)基作為空白對照組，繼續(xù)孵育24 h后，吸去上清液，每孔加入0.5 mg/mL MTT 溶液100 μL。37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄上清液，每孔加入100 μL DMSO 充分振蕩 10 min 溶解結(jié)晶，用酶標儀在570 nm 處測定吸光度。

1.5.4 ROS含量檢測 分為空白對照組，模型組(LPS 1 μg/mL)，給藥組包括LPS 1 μg/mL+QGD 31.25 μg/mL組、LPS 1 μg/mL+QGD 62.50 μg/mL組、LPS 1 μg/mL+QGD 125.00 μg/mL組，每組3個復(fù)孔。將細胞等密度地接種至12孔板中，每孔1 mL，密度大約為 1.5×105個/孔，置于恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)18 h后，將培養(yǎng)基更換為無血清的培養(yǎng)基饑餓4 h，棄去上清液，按照分組加藥孵育23 h 30 min，將 12 孔板中的培養(yǎng)基換為含有10 μmol/LDCFH-DA 的PBS繼續(xù)孵育30 min，之后將PBS吸出，使用胰酶消化細胞，加入培養(yǎng)基終止消化，制成細胞懸液，離心5～10 min收集細胞，用PBS洗滌1次或2次，離心收集細胞沉淀物用PBS重懸后用于熒光分光光度計檢測。最佳激發(fā)波長485(500±15) nm，最佳發(fā)射波長525(530±20) nm。

1.5.5 ELISA檢測細胞上清液中TNF-α濃度 分為空白對照組、模型組(LPS 1 μg/mL)、給藥組不同劑量亞組即LPS 1 μg/mL+QGD 31.25 μg/mL組、LPS1 μg/mL+QGD 62.50 μg/mL組、LPS 1 μg/mL+QGD 125.00 μg/mL組，每組3個復(fù)孔。等密度接種至12孔板，置于恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)18 h 后將培養(yǎng)基更換為空白培養(yǎng)基饑餓4 h，棄去上清液，按照分組加藥孵育24 h，吸取上清液，轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的1.5 mL離心管中，按照ELISA試劑盒說明對樣本進行處理后采用酶標儀進行讀數(shù)(波長450 nm)，再根據(jù)試劑盒提供的換算公式得出結(jié)果。

1.5.6 MDA含量測定 分為空白對照組，模型組(LPS 1 μg/mL)，給藥組(LPS 1 μg/mL+QGD 31.25 μg/mL組、LPS1 μg/mL+QGD 62.50 μg/mL組、LPS 1 μg/mL+QGD 125.00 μg/mL組)，每組3個復(fù)孔。將細胞等密度地接種至12孔板中，置于恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)18 h 后將培養(yǎng)基更換為無血清的培養(yǎng)基饑餓4 h，棄去上清，按照分組加藥孵育24 h，吸取上清液，轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的1.5 mL離心管中，按照試劑盒說明對樣本進行處理后采用酶標儀進行讀數(shù)(波長532 nm)。計算公式為細胞上清液中MDA含量=(測定OD值-對照OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

1.5.7 GSH-Px含量測定 按空白對照組、模型組(LPS 1 μg/mL)、給藥組(LPS 1 μg/mL+QGD 31.25 μg/mL組、LPS1μg/mL+QGD62.50μg/mL組、LPS1 μg/mL+QGD 125.00 μg/mL組)分為5組，每組3個復(fù)孔。將細胞等密度地接種至12孔板中，置于恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)18 h 后將培養(yǎng)基更換為無血清的培養(yǎng)基饑餓4 h，棄去上清液，按照分組加藥孵育24 h ，吸取上清液，轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的1.5 mL離心管中，按照試劑盒說明對樣本進行處理后采用酶標儀進行讀數(shù)(波長412 nm)。計算公式：培養(yǎng)上清液中GSH-Px活力單位=(非酶管OD值-酶管OD值)/(標準管OD值-空白管OD值)×標準管濃度(20 μmol/L)×稀釋倍數(shù)×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

1.5.8 Western Blot法檢測 Nrf2、細胞核內(nèi)Nrf2、p38、p-p38、HO-1蛋白表達及p38抑制劑(LY2228820)干預(yù)LPS誘導(dǎo)的BV-2細胞后HO-1蛋白的表達情況 細胞鋪板后匯合度至40%～50%時，吸去上清液，換成空白培養(yǎng)基饑餓4 h，之后將清達顆粒母液(5 mg/mL)化凍后依照實驗?zāi)康挠猛耆囵B(yǎng)基分別稀釋至31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL 3個干預(yù)濃度，并按組分別換液，另外，空白對照組及LPS組則用完全培養(yǎng)基換液，每組3個復(fù)孔。再加入QDG 12 h后，除空白對照組外每孔分別加入20 μL脂多糖母液(1 mg/mL)。檢測p38、p-p38、Nrf2、HO-1以及細胞核內(nèi)Nrf2指標的細胞均繼續(xù)孵育12 h。后用NP-40蛋白裂解液裂解細胞，每5 min震蕩1次，裂解15 min，4 ℃下14 000 r/min離心20 min，吸取上清液獲取總蛋白。核蛋白則采用細胞核蛋白提取法提取，之后根據(jù)BCA蛋白定量結(jié)果上樣。95 ℃變性5 min，SDS-PAGE 凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h ，4 ℃一抗孵育過夜，TBST洗5 min×3次，室溫孵育二抗1 h，TBST洗5 min×3次，曝光顯影，采用 BIO-RAD Image Lab 軟件進行灰度值分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度LPS對BV-2細胞的細胞活力影響 LPS濃度處于1 μg/mL及以下時對 BV-2 細胞不造成毒性，可在此濃度范圍內(nèi)用于后續(xù)細胞實驗的干預(yù)。LPS組(3 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL)BV-2細胞的細胞活力分別為(85±4)%、(72±2)%、(70±6)%，與空白對照組(100±6)%比較均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，LPS濃度為1 μg/mL時細胞活力為(91±7)%，與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖1。

與空白對照組比較，*P<0.05。圖1 不同濃度LPS對BV-2細胞的細胞活力影響

2.2 不同濃度清達顆粒對BV-2細胞的細胞活力影響 清達顆粒濃度處于125 μg/mL及以下時對BV-2細胞不造成毒性，可在該濃度范圍內(nèi)用于后續(xù)細胞實驗的干預(yù)。清達顆粒組(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)BV-2細胞的細胞活力分別為(100±5)%、(98±10)%、(92±3)%，與空白對照組細胞活力(100±3)%相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。QDG250.00 μg/mL組、500.00 μg/mL組細胞活力分別為(84±7)%、(68±2)%，與空白對照組比較下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2。

與空白對照組比較，*P<0.05。圖2 不同濃度清達顆粒對BV-2細胞的細胞活力影響

2.3 清達顆粒對LPS干預(yù)的BV-2細胞的細胞活力影響 LPS(1 μg/mL)與清達顆粒(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)共同干預(yù)時對BV-2細胞不造成毒性。LPS組的BV-2細胞活力為(106±3)%，與空白對照組細胞活力(100±2)%比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；LPS+QDG組(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)細胞活力分別為(107±2)%、(122±2)%、(109±3)%，與LPS組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，LPS+QDG 62.5 μg/mL組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖3。

與空白對照組比較，*P<0.05。

2.4 清達顆粒對LPS干預(yù)的BV-2細胞中ROS含量影響 LPS組BV-2細胞中ROS熒光強度與空白對照組比較升高(P<0.01)；LPS+QDG(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL)組與LPS組相比下降(P<0.01)。詳見圖4。

與LPS組比較，*P<0.01；與空白對照組比較，#P<0.01。 圖4 清達顆粒對LPS干預(yù)的BV-2細胞中釋放的ROS熒光強度

2.5 清達顆粒對LPS干預(yù)的BV-2細胞上清液中TNF-α濃度影響 LPS組BV-2細胞上清液中TNF-α濃度與對照組比較升高(P<0.01)；LPS+QDG組(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)與LPS組相比下降(P<0.01)。詳見表1。

組別樣本量(份)TNF-α濃度(pg/mL)MDA(nmol/mL)GSH-Px活力單位空白對照組3326.00±6.121.30±0.3017.07±1.22LPS組31 428.00±12.12②2.00±0.02①11.38±1.41①LPS+QDG 31.25 μg/mL組3 985.10±50.01④1.33±0.20③8.33±3.35LPS+QDG 62.50 μg/mL組3909.34±8.87④1.26±0.11③20.32±5.63④LPS+QDG 125.00 μg/mL組3849.74±8.34④1.89±0.2519.51±3.22④

與空白對照組比較，①P<0.05，②P<0.01；與LPS組比較，③P<0.05，④P<0.01。

2.6 清達顆粒對LPS干預(yù)的BV-2細胞上清液中MDA含量的影響 LPS組的BV-2細胞上清液中MDA含量與空白對照組比較升高(P<0.05)；LPS+QDG(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)組與LPS組相比均下降(P<0.05)。詳見表2。

2.7 清達顆粒對LPS干預(yù)的BV-2細胞中GSH-Px含量的影響 LPS組的BV-2細胞上清液中GSH-Px活力單位與空白對照組比較降低(P<0.05)；LPS+QDG組(62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)與LPS組相比上升(P<0.01)。詳見表3。

2.8 清達顆粒對LPS干預(yù)的BV-2細胞的Nrf2、細胞核內(nèi)Nrf2、p38、p-p38、HO-1蛋白表達的影響以及p38抑制劑作用下清達顆粒干預(yù)LPS誘導(dǎo)的BV-2細胞HO-1蛋白表達的影響 LPS組BV-2細胞中p-p38蛋白的表達與空白對照組比較下降(P<0.05)；LPS+QDG組(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)與LPS組相比上升(P<0.05)。詳見圖5。

LPS組BV-2細胞核中Nrf2蛋白的表達與空白對照組比較降低(P<0.05)；LPS+QDG組(31.25 μg/mL、125.00 μg/mL)與LPS組相比上升(P<0.05)。詳見圖6。

LPS組BV-2細胞中HO-1蛋白的表達與空白對照組比較降低(P<0.05)；LPS+QDG組(31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125.00 μg/mL)與LPS組相比上升(P<0.05)。詳見圖7。

LPS組的BV-2細胞中HO-1蛋白表達與空白對照組比較降低(P<0.05)；LY2228820+LPS組的BV-2細胞中HO-1蛋白表達與LPS組比較降低(P<0.05)；LY2228820+LPS+QDG(62.50 μg/mL)組與LPS+QDG(62.50 μg/mL)組相比下降(P<0.05)；LY2228820+LPS+QDG(62.50 μg/mL)組與LY2228820+LPS組相比明顯升高(P<0.05)。詳見圖8。

與LPS組比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05。 圖5 清達顆粒對LPS干預(yù)的BV-2細胞中p38、磷酸化p38蛋白表達的影響

與LPS組比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05。圖6 清達顆粒對LPS干預(yù)的BV-2細胞中Nrf2以及細胞核中Nrf2蛋白表達的影響

與LPS組比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05。圖7 清達顆粒對LPS干預(yù)的BV-2細胞中HO-1蛋白表達的影響

與LPS組比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05。 圖8 p38抑制劑干預(yù)后清達顆粒對LPS干預(yù)的BV-2細胞中HO-1蛋白表達的影響

3 討 論

高血壓可引起多種靶器官損害，高血壓性腦損傷即為其諸多并發(fā)癥之一。近年來研究表明，當人體處于高血壓狀態(tài)下，體內(nèi)會釋放更多的ROS，產(chǎn)生大量自由基、脂質(zhì)過氧化物等有害化學(xué)基團，機體無法及時清除它們，氧化代謝平衡被打亂，從而進入氧化應(yīng)激狀態(tài)[12]。腦部相較其他器官此種現(xiàn)象更為嚴重[13]，腦內(nèi)神經(jīng)細胞因有害化學(xué)基團堆積而產(chǎn)生細胞毒性，構(gòu)成細胞的物質(zhì)如脂質(zhì)、蛋白、DNA、RNA出現(xiàn)損傷，線粒體功能出現(xiàn)障礙，造成細胞損傷和壞死，進而損傷神經(jīng)及腦血管，最終可造成大腦皮層的損害[1]。不僅如此，因高血壓所釋放的ROS也會激活如p53、NF-κB等多種信號通路導(dǎo)致細胞凋亡[14]。由此可見，高血壓所致的氧化應(yīng)激損傷是造成腦損傷的重要原因之一。

小膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)的一種神經(jīng)膠質(zhì)細胞。當高血壓等疾病造成腦內(nèi)ROS大量釋放時，小膠質(zhì)細胞會因其刺激過度活化，釋放大量氧自由基等有害化學(xué)基團以及大量有神經(jīng)毒性的炎癥介質(zhì)，加重炎癥及氧化應(yīng)激，形成惡性循環(huán)，加劇顱腦損傷[15]。因此，本研究中將小膠質(zhì)細胞作為研究對象，通過抗氧化治療避免小膠質(zhì)細胞過度活化，進而減輕腦損傷。

清達顆?？捎行Э刂谱园l(fā)性高血壓大鼠血壓，并減輕其靶器官損害的功效已被證實。褚劍鋒等[6]研究表明，自發(fā)性高血壓大鼠經(jīng)清達顆粒灌胃3周后血壓已明顯低于對照組，8周后腎小球固縮、心肌纖維腫脹等靶器官損傷均有顯著改善。楊美玲等[16]研究指出清達顆?？山档脱芫o張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的高血壓小鼠血壓，并改善其腎臟損傷。除此之外，清達顆粒中單味藥的有效成分如天麻素、黃芩苷、異鉤藤堿等對LPS誘導(dǎo)的細胞炎癥反應(yīng)及氧化損傷也有一定的抑制功效[7-10]。而蓮子心的有效成分甲基蓮心堿可減輕高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞氧化應(yīng)激損傷[11]。但是目前對清達顆粒本身潛在的抗炎、抗氧化應(yīng)激功效尚未被廣泛研究。因此，本課題選用BV-2小鼠小膠質(zhì)細胞系，采用LPS構(gòu)建細胞炎癥反應(yīng)模型，觀察清達顆粒對炎癥細胞抗氧化應(yīng)激的影響。實驗結(jié)果表明清達顆粒可以顯著抑制活化的小膠質(zhì)細胞釋放如ROS、TNF-α及MDA等細胞毒性物質(zhì)，并一定程度促進抗氧化酶如GSH-Px的產(chǎn)生及釋放，起到了抗氧化應(yīng)激的作用。

中草藥作為抗氧化劑清除自由基對抗氧化應(yīng)激及炎癥損傷的報道屢見不鮮，不僅如此，部分中草藥的有效成分可通過激活抗氧化信號通路，生成內(nèi)源性抗氧化酶以抑制氧化應(yīng)激損傷。其中p38MAPK/Nrf2/HO-1信號傳導(dǎo)通路被證實與腦等重要器官的抗氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，該通路的激活減輕了氧化應(yīng)激帶來的損傷，進而保護了腦等重要臟器[17]。在氧化應(yīng)激時，產(chǎn)生的ROS經(jīng)由p38MAPK信號通路使穩(wěn)定狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2磷酸化，解除與keap-1的結(jié)合而轉(zhuǎn)位至細胞核，在細胞核與一種重組蛋白形成異二聚體并同抗氧化元件相結(jié)合，從而啟動HO-1基因的轉(zhuǎn)錄。HO-1是經(jīng)典的內(nèi)源性抗氧化酶，具有良好的抑制氧化應(yīng)激及炎癥的作用，而該信號通路除了具有保護重要臟器的作用外，還對神經(jīng)系統(tǒng)有保護作用[5]。該通路是否是清達顆?？寡趸饔每赡艿母深A(yù)通路目前尚未被研究證實。本實驗研究發(fā)現(xiàn)清達顆?？纱偈够罨腂V-2細胞內(nèi) p38 蛋白磷酸化，轉(zhuǎn)位進入細胞核的Nrf2增多，并產(chǎn)生更多的 HO-1。除此之外，運用 p38MAPK 激酶抑制劑(LY2228820)進行干預(yù)后HO-1蛋白的表達量明顯減少。本實驗結(jié)果表明清達顆?？赡芡ㄟ^ p38MAPK/Nrf2/HO-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起到一定程度的抗氧化應(yīng)激作用。此外，清達顆粒還可能作用于其他 MAPK 信號通路或其他抗氧化信號通路和靶點，進而誘導(dǎo)HO-1基因表達。

目前清達顆粒對腦細胞氧化應(yīng)激調(diào)控是否存在其他作用靶點或信號通路仍值得繼續(xù)研究，本實驗為進一步闡明清達顆粒對腦細胞氧化應(yīng)激的調(diào)控機制以及清達顆粒對高血壓靶器官保護提供了一定的實驗依據(jù)。