硝酸益康唑微乳凝膠的制備及其體外釋放研究

丁 樂，楊人澤 ，李小蘭，肖人鐘，歐陽文，嚴(yán)金玲，申 音，魏桂林

（1. 江西省贛州市婦幼保健院，江西 贛州 341000； 2. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000；3. 江西昂泰制藥有限公司，江西 九江 332300）

1 儀器、試藥與動(dòng)物

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；RCZ －6C3 型智能藥物溶出度儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；HWS－1 型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（杭州儀表電機(jī)有限公司）；XP26 型電子分析天平（瑞士梅特勒公司，精度為百萬分之一）；NDJ－8S 型數(shù)顯旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)（上海精天電子儀器有限公司）。

1.2 試藥

甲醇（色譜純，德國(guó)默克公司）；磷酸（分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司）；硝酸益康唑（浙江常青化工有限公司，純度為98.6%）；硝酸益康唑?qū)φ掌罚ㄖ袊?guó)食品藥品檢定研究院）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

屏障環(huán)境昆明種小鼠，雌雄不限，體質(zhì)量20 ～30 g，由贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SYXK(贛)2018 －0004。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇－醋酸緩沖液（75 ∶25，V／ V，pH ＝4.3）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：232 nm；進(jìn)樣量：10 μL。按硝酸益康唑峰計(jì)算，理論板數(shù)不小于5 000。

2.1.2 微乳和微乳凝膠破乳

取1 g 微乳或微乳凝膠，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加5 mL 甲醇，超聲破乳，加甲醇定容。再取0.5 mL溶液置10 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相定容，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

一種新技術(shù)的誕生和普及，也常常會(huì)對(duì)當(dāng)時(shí)的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)生活產(chǎn)生暫時(shí)的負(fù)面影響。人工智能的機(jī)器人等自動(dòng)化系統(tǒng)在某些行業(yè)領(lǐng)域中比人類在功能、效率、成本乃至穩(wěn)定性方面更具優(yōu)勢(shì)。企業(yè)出于經(jīng)濟(jì)效益的考慮，顯然更愿意在這些領(lǐng)域，減少甚至不用人力。如果在目前的出租車行業(yè)廣泛應(yīng)用無人駕駛技術(shù)來取代人類司機(jī)，顯然會(huì)導(dǎo)致出租車司機(jī)的大量減少；甚至在餐飲行業(yè)如海底撈等企業(yè)，已開始推出智慧餐廳并正式營(yíng)業(yè)，實(shí)現(xiàn)了等位點(diǎn)餐、廚房配菜、調(diào)制鍋底和送菜的全程“無人化”，同樣會(huì)減少員工崗位，但也會(huì)創(chuàng)造新的崗位。

硝酸益康唑?qū)φ掌?、空白微乳、硝酸益康唑微乳按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，詳見圖1。硝酸益康唑與雜質(zhì)峰分離良好，雜質(zhì)峰對(duì)測(cè)定結(jié)果無干擾。依法制備質(zhì)量濃度分別為1，2，4，6，8，10 μg／mL 的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣20 μL。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y ＝34.624 X－2.101 5，R ＝0.999 3，結(jié)果表明硝酸益康唑質(zhì)量濃度在1 ～10 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2 表觀溶解度測(cè)定

分別取2 mL 選定的油、表面活性劑、助表面活性劑，分別置5 mL 帶塞小瓶中，再加入過量的硝酸益康唑，渦旋混合。將小瓶置（37 ±1.0）℃的搖床，保持48 h，以達(dá)到平衡。取出，以3 000 r／min 離心15 min，取上清液，加甲醇稀釋，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定硝酸益康唑含量，計(jì)算其在不同溶劑中的溶解度[4]。結(jié)果見表1。根據(jù)測(cè)定結(jié)果選擇表觀溶解度最高的油酸乙酯為油相，Tween 80 為表面活性劑，聚乙二醇400(PEG 400)為助表面活性劑。

表1 硝酸益康唑在各溶劑中的表觀溶解度（n ＝3）

2.3 偽三元相圖構(gòu)建

當(dāng)表面活性劑（ Tween 80 ）／助表面活性劑（ PEG 400）比值（Km）分別為1.0，2.0，3.0 時(shí)，分別將油相和混合乳化劑以1 ∶9，2 ∶8，3 ∶7，4 ∶6，5 ∶5，6 ∶4，7 ∶3，8 ∶2，9 ∶1 的質(zhì)量比例混合成二元液，置圓底燒瓶中，以純化水為水相在滴定管內(nèi)逐滴滴入上述二元液，以體系由澄清變渾濁再變澄清時(shí)為滴定終點(diǎn)，記錄所滴定的水相體積，繪制空白微乳偽三元相圖[5]。各Km 值下的偽三元圖見圖2。微乳區(qū)為灰色陰影部分。當(dāng)Km 值由1.0 增大至2.0 時(shí)，微乳區(qū)域增大；但當(dāng)Km 值由2.0 逐漸增大時(shí)，微乳形成的區(qū)域縮小。故選擇Km 為3 ∶1。

2.4 表征[2，6 －7]

微乳制備：通過構(gòu)建偽三元相圖確定微乳區(qū)域。當(dāng)Tween 80 ／PEG 400( m ／ m)為2 ∶1 時(shí)，偽三元相圖有最高的微乳區(qū)域面積，因此選擇表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比為2 ∶1。制備含量為1 % 硝酸益康唑的100 g微乳，藥物溶解度最低要求39.3 mL 油，故按油相百分比大于40%設(shè)計(jì)微乳處方，詳見表2。在油酸乙酯、表面活性劑和輔助表面活性劑混合物中加入質(zhì)量比為1%（m ／ m）的硝酸益康唑，在恒溫水?。?7 ℃）磁力攪拌下逐一滴加水形成微乳。

圖1 高效液相色譜圖

圖2 Tween 80 ／PEG 400 不同比值的偽三元圖

表2 混合乳化劑制備微乳處方（m ／ m，%）

微乳凝膠制備：取0.5 % 卡波姆940 分散在水中，溶脹后，快速攪拌，并緩慢加入上述硝酸益康唑微乳。當(dāng)微乳液加入水凝膠中時(shí)，體系黏度降低，繼續(xù)攪拌15 min，即得半透明的硝酸益康唑微乳凝膠。

表征：微乳透光率評(píng)估用紫外分光光度計(jì)于620 nm波長(zhǎng)處觀察。采用2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》中0982粒徑和粒度分布測(cè)定法第三法（光散射法）測(cè)定粒徑。參照2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》測(cè)定pH 及Zeta 電位。結(jié)果，微乳的pH 為6.5 ～6.8，所得制劑的pH 均在皮膚的pH 范圍內(nèi)（pH 為4 ～7）。微乳粒徑尺寸是關(guān)鍵參數(shù)，尺寸越小，為藥物滲透提供的界面表面積就越大。粒徑采用激光粒度儀測(cè)定，溫度為37 ℃。微乳粒徑分布范圍較窄，呈正態(tài)分布，平均粒徑均小于50 nm。采用NDJ－8S 型數(shù)顯旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)，（20 ±1）℃測(cè)定微乳和微乳凝膠的黏度，結(jié)果微乳（F3）黏度為156.73 mPa·s，微乳凝膠（FG3）黏度增加至13.6 Pa·s。詳見表3。

穩(wěn)定性：在(40 ±2)℃和相對(duì)濕度(75 ±5)% 條件下，放置30 d。結(jié)果見表4，微乳凝膠無顯著變化，無相分離或藥物沉淀的跡象，表明優(yōu)化硝酸益康唑微乳凝膠在室溫下在30 d 內(nèi)穩(wěn)定。

表3 用于評(píng)價(jià)不同微乳的數(shù)據(jù)（n ＝3）

表4 微乳凝膠（FG3）30 d 內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n ＝3）

2.5 體外擴(kuò)散試驗(yàn)

取20 ～25 g 健康昆明種小鼠，試驗(yàn)前1 d 用8 %的Na2S 溶液去背毛。斷頸處死，取背部皮膚，用蒸餾水和生理鹽水沖洗，刮去皮下脂肪組織和粘連物，冷凍保存。使用改良Franz 擴(kuò)散池。將硝酸益康唑微乳1 mL、含有等量硝酸益康唑的微乳凝膠和硝酸益康唑普通凝膠分別置供給池中，滲透面積為0.85 cm2，擴(kuò)散池中以30%甲醇生理鹽水為接受液，接受池體積為5 mL。在接收室內(nèi)加滿擴(kuò)散介質(zhì)，水浴保溫（37 ±1）℃，100 r／min 攪拌，分別于1，2，3，4，5，6 h 時(shí)抽取接收室內(nèi)0.5 mL 接收液，并迅速補(bǔ)充等體積接收液。將取得的樣品注入高效液相色譜儀，測(cè)定硝酸益康唑的含量。

測(cè)定抽取樣品中硝酸益康唑的濃度后，按下列公式計(jì)算單位面積（cm2）藥物累積滲透量（Q）。

其中， Cn為第 n個(gè)取樣點(diǎn)質(zhì)量濃度（mg ／ mL）；V0為擴(kuò)散池體積（mL）；Ci為第i 個(gè)取樣點(diǎn)質(zhì)量濃度（mg／mL）；V 為取樣體積（mL）；A 為擴(kuò)散面積（cm2）。采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算藥物累積經(jīng)皮滲透量。體外皮膚滲透試驗(yàn)表明，與24 h 結(jié)束時(shí)硝酸益康唑普通凝膠釋放率[（62.59 ±0.26）% ]相比，微乳凝膠的藥物釋放率更高[（86.79 ±0.17）%]，詳見圖3。

2.6 皮膚刺激性測(cè)試

圖3 硝酸益康唑微乳凝膠和普通凝膠通過大鼠皮膚累積滲透比較

選擇健康無皮膚傷的大鼠6 只，分為兩組，兩側(cè)去毛1 cm2，取無損傷者3 只，進(jìn)行完整皮膚的刺激試驗(yàn)；取3 只將脫毛區(qū)皮膚用75%乙醇消毒，用滅菌大頭針將消毒皮膚劃破，以滲血為度。采用同體左右側(cè)自身對(duì)比的方法，按每只1 mL 的劑量在脫毛區(qū)左側(cè)涂搽受試藥物，右側(cè)涂搽蒸餾水作對(duì)照。用藥后24，48，72 h 時(shí)檢查大鼠的刺激跡象。結(jié)果顯示，治療組在治療部位沒有顯示任何皮膚過敏和炎癥的跡象，無紅斑形成，無水腫出現(xiàn)；破損皮膚組和完整皮膚組大鼠涂受試物皮膚均未見差異。優(yōu)選的微乳凝膠均適用于局部應(yīng)用。

3 討論

外用制劑用于藥物穿透皮膚或黏膜，在其應(yīng)用部位產(chǎn)生局部效應(yīng)。經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)是能選擇性地將藥物輸送到特定部位，產(chǎn)生局部作用，其增加了生物半衰期短、治療窗口窄藥物臨床應(yīng)用的可能，并增加了藥物作用持續(xù)時(shí)間[8]。

微乳是由乳化劑、助乳化劑、油相和水相組成的光學(xué)上各向同性，熱力學(xué)穩(wěn)定的液－液分散體，粒徑為5 ～200 nm。由于其獨(dú)特的增溶性能，微乳作為潛在的藥物輸送系統(tǒng)引起了越來越多的關(guān)注，無論是作為局部應(yīng)用的載體，還是作為難溶性活性藥物成分（API）的生物利用度增強(qiáng)劑[9]。微乳液具有熱力學(xué)穩(wěn)定、光學(xué)清晰、易于制備的優(yōu)點(diǎn)，與無表面活性劑體系相比，具有較高的擴(kuò)散和吸收速率[10]。作為一種新型藥物載體，微乳優(yōu)勢(shì)獨(dú)特，熱力學(xué)穩(wěn)定，可過濾，易制備，保存方便，可提高水溶性差藥物的生物利用度，透皮能力強(qiáng)[11－12]，療效提高。

微乳凝膠（乳劑型凝膠）含有乳劑和凝膠基質(zhì)，當(dāng)局部應(yīng)用黏膜給藥時(shí)，藥－時(shí)曲線下面積有很大提高[13]?？ú窞橐凉裥院軓?qiáng)的粉末，不溶解于水，能迅速溶脹，形成水性凝膠，是微乳凝膠的常用基質(zhì)。

本研究中制備的1%硝酸益康微乳，性質(zhì)穩(wěn)定，顯著增加了硝酸益康唑的溶解度。微乳中加入卡波姆940，可使微乳制備成凝膠后黏度增加[2]。藥物釋放時(shí)需先從微乳內(nèi)相擴(kuò)散到外相，然后再從凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中滲透出來，因此滲透速度會(huì)有所下降；也可能是由于卡波姆的加入使得微乳的結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，由內(nèi)外兩項(xiàng)轉(zhuǎn)變?yōu)橐壕ЫY(jié)構(gòu)或更高秩序的微結(jié)構(gòu)。這與劉繼勇等[14]的研究結(jié)果一致。

因此，微乳凝膠提高了硝酸益康唑的溶解性、穩(wěn)定性和透皮率，可進(jìn)一步研究硝酸益康唑微乳凝膠的藥效。